Name: فحص مضان القائم من الفوسفوليبيدية Scramblase آخر (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: اكتشف طريقة فحص مضان الفوسفوليبيدات في الحويصلات الدهنية الكبيرة باستخدام الأوبسين لفهم آليات نقل الدهون بين الخلايا. هذه التقنية موثوقة وقوية لدراسة ديناميكيات الدهون.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة Velux Stiftung (A.K.M.) و EY024207 منحة المعاهد الوطنية للصحة (AKM) ومشروع الصندوق النمساوي للعلوم (FWF) J3686 (B.P.).

<ol><li>Ernst, O. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+and+animal+rhodopsins%3A+structures%2C+functions%2C+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms.</a> Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).</li>
<li>Menon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsin+is+a+phospholipid+flippase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol.+CB%22%5BJournal%5D)">Opsin is a phospholipid flippase.</a> Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).</li>
<li>Goren, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+phospholipid+scramblase+activity+of+a+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor.</a> Nat. Commun. 5, 5115(2014).</li>
<li>Ernst, O. P., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+scrambling+by+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci.+Off.+J.+Eur.+Photochem.+Assoc.+Eur.+Soc.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Phospholipid scrambling by rhodopsin.</a> Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. , (2015).</li>
<li>Sanyal, S., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flipping+lipids%3A+why+an%27+what%27s+the+reason+for%3F%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flipping lipids: why an' what's the reason for?</a> ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).</li>
<li>Bevers, E. M., Williamson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+scramblase%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Phospholipid scramblase: an update.</a> FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).</li>
<li>Leventis, P. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+and+function+of+phosphatidylserine+in+cellular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes.</a> Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).</li>
<li>Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCA4+is+an+N-retinylidene-phosphatidylethanolamine+and+phosphatidylethanolamine+importer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer.</a> Nat. Commun. 3, 925(2012).</li>
<li>Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-binding+cassette+transporter+ABCA4+and+chemical+isomerization+protect+photoreceptor+cells+from+the+toxic+accumulation+of+excess+11-cis-retinal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).</li>
<li>Ben-Shabat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+nonaoxirane+from+A2E%2C+a+lipofuscin+fluorophore+related+to+macular+degeneration%2C+and+evidence+of+singlet+oxygen+involvement%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement.</a> Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).</li>
<li>Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+meets+all-trans-retinal%3A+the+making+of+RPE+bisretinoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids.</a> J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).</li>
<li>Schütt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodamage+to+human+RPE+cells+by+A2-E%2C+a+retinoid+component+of+lipofuscin%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).</li>
<li>Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMEM16+proteins%3A+unknown+structure+and+confusing+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions.</a> J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).</li>
<li>Mohammadi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FtsW+as+a+transporter+of+lipid-linked+cell+wall+precursors+across+the+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane.</a> EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).</li>
<li>Meeske, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MurJ+and+a+novel+lipid+II+flippase+are+required+for+cell+wall+biogenesis+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).</li>
<li>Ruiz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Flippases+for+Bacterial+Peptidoglycan+Biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Lipid+Insights%22%5BJournal%5D)">Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis.</a> Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).</li>
<li>Rick, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+the+wzxE+gene+of+Escherichia+coli+K-12+encodes+a+protein+involved+in+the+transbilayer+movement+of+a+trisaccharide-lipid+intermediate+in+the+assembly+of+enterobacterial+common+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen.</a> J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).</li>
<li>Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+phosphatidylserine+by+Xk-related+protein+family+members+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis.</a> J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).</li>
<li>Suzuki, J., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+scrambling+on+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Phospholipid scrambling on the plasma membrane.</a> Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).</li>
<li>Alaimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+but+interchangeable+mechanisms+for+flipping+of+lipid-linked+oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides.</a> EMBO J. 25, 967-976 (2006).</li>
<li>Ernst, C. M., Peschel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+antimicrobial+peptide+restistance+by+MprF-mediated+aminoacylation+and+flipping+of+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbial%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids.</a> Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).</li>
<li>Vehring, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flip-flop+of+fluorescently+labeled+phospholipids+in+proteoliposomes+reconstituted+with+Saccharomyces+cerevisiae+microsomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins.</a> Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).</li>
<li>Rouser, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+dimensional+then+%5Bsic%5D+layer+chromatographic+separation+of+polar+lipids+and+determination+of+phospholipids+by+phosphorus+analysis+of+spots%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots.</a> Lipids. 5, 494-496 (1970).</li>
<li>Rigaud, J. -L., Lévy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li>
<li>Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+reconstitution+of+ABC+transporters+and+assays+of+translocator+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function.</a> Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).</li>
<li>Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+vesicle+formation+and+transmembrane+protein+incorporation+using+octyl+glucoside%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside.</a> Biochemistry. 20, 833-840 (1981).</li>
<li>Malvezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-dependent+phospholipid+scrambling+by+a+reconstituted+TMEM16+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel.</a> Nat. Commun. 4, 2367(2013).</li>
<li>Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter+is+a+flippase+for+glucosylceramide+and+other+simple+glycosphingolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids.</a> Biochem. J. 389, 517-526 (2005).</li>
<li>Marek, M., Günther-Pomorski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+Flippase+Activity+in+Proteoliposomes+Using+Fluorescent+Lipid+Derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives.</a> Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).</li>
<li>Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+purification%2C+and+functional+reconstitution+of+the+P4-ATPase+Atp8a2%2C+a+phosphatidylserine+flippase+in+photoreceptor+disc+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes.</a> J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).</li>
<li>Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+P4-ATPases+and+ABC+transporters+and+their+role+in+phospholipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).</li>
<li>Romsicki, Y., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+flippase+activity+of+the+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter.</a> Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).</li>
<li>Zhou, X., Graham, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+phospholipid+translocase+activity+with+purified+Drs2p%2C+a+type-IV+P-type+ATPase+from+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

فحص النشاط scramblase مكنتنا أصلا لتحديد ما أوبسين ديه فوسفورية النشاط scramblase 2. يسمح فحص لنا أيضا لوصف النشاط scramblase أوبسين عن طريق اختبار خصوصية (كنا مجموعة متنوعة من الدهون مراسل المسمى دبي الوطني مثل بنك دبي الوطني فسفاتيديل إيثانولامين، وصفت مع بنك دبي الوطني على سلسلة أسيل كما هو مبين لبنك دبي الوطني-PC في الشكل 1A، أو على headgroup، بنك دبي الوطني، سفينغوميالين أو NBD- فسفاتيديل 2)، وتأثير حويصلة تكوين الدهون (على سبيل المث...

رودوبسين مستقبلة للضوء، وهو نموذج أولي G البروتين يقترن مستقبلات (مراجعة على سبيل المثال، في اشارة 1)، هو أول scramblase فوسفورية الكشف عن هويته والتحقق منها كيميائيا 2،3. Scramblases هي النقل فوسفورية التي تزيد من بطء في جوهرها من transbilayer حركة فوسفورية على الناحية الفسيولوجية المستويات الملائمة في ثنائي الاتجاه، بطريقة ATP مستقلة 4-6. أمثلة من تصرفاتهم يمكن العثور عليها في الشبكة الإندوبلازمية وغشاء هيولي البكتيرية التي تحتاج إلى الهرولة التأسيسي للتوازن الغشاء والنمو، فضلا عن مجموعة متنوعة من مسارات بالغليكوزيل 5. فوسفورية ينظم الهرولة هناك حاجة لفضح فسفاتيديل (PS) على سطح الخلايا أفكارك حيث أنه بمثابة &quot;أكل لي&quot; -signal لالضامة 7 و يوفر سطح محفز التخثر على الصفائح الدموية تنشيط لتحفيز إنتاج بروتين عاملق اللازمة لتخثر الدم. في مبصرة الأغشية القرص، وقد اقترح النشاط الهرولة رودوبسين لمواجهة الخلل فوسفورية بين اثنين من منشورات غشاء من طبقة ثنائية التي يتم إنشاؤها من قبل لاعبي التنس المحترفين التي تعتمد، الدهن أحادي الاتجاه flippase ABCA4 4،8،9 10-12. وعلى الرغم من أهمية الفسيولوجية للscramblases، وظلت هويتهم بعيد المنال حتى أفيد رودوبسين باعتباره scramblase في أقراص مستقبلة للضوء 2، تم تحديد أعضاء الأسرة البروتين TMEM16 كما كا 2+ scramblases معتمد على الحاجة للتعرض PS في غشاء البلازما (مراجعة في إشارة 13)، واقترح البروتين البكتيري FtsW باعتباره الدهن الثاني scramblase المطلوبة لتخليق ببتيدوغليكان 14. واستندت هذه الاكتشافات على إعادة تشكيل تنقية البروتينات في الجسيمات الشحمية ومظاهرة من النشاط scramblase في proteoliposomes الناتجة باستخدام describ منهجيةإد هنا. scramblases إمكانات أخرى 15-21 - البروتينات MurJ وAMJ المتورطين في التركيب الحيوي ببتيدوغليكان، WzxE والبروتينات ذات الصلة المتورطين في الهرولة السلائف-O مستضد، البروتين منتدى مادهيسي اللازمة لنقل من phosphatidylglycerol aminoacylated عبر غشاء هيولي البكتيرية، وأفراد الأسرة Xkr8 أنه قد أقترح لفضح PS على سطح الخلايا أفكارك - لا يزال يتعين اختبار كيميائيا. هذا يسلط الضوء على أهمية فحص قوية لتحديد وتوصيف النشاط scramblase. هنا، نحن تصف إعادة تشكيل أوبسين النقي، وصميم بروتيني من رودوبسين مبصرة، إلى الحويصلات unilamellar كبيرة (LUVs)، وتحليل لاحقة من النشاط scramblase في proteoliposomes الناتجة باستخدام مقايسة على أساس مضان. وهناك العديد من البروتوكولات وصفها جيدا المتاحة في الأدب للتعبير مغاير وتنقية أوبسين، وبالتالي فإننا لن<html> وصف في هذا البروتوكول. نستخدم البروتوكولات المذكورة في غورين وآخرون. (3) الذي ينتج العلم الموسومة، أوبسين بالحرارة بنحو 100 نانوغرام / ميكرولتر في 0.1٪ (ث / ت) dodecylmaltoside (DDM). ويتحقق إعادة بواسطة علاج LUVs مع المنظفات كافية بحيث تنتفخ ولكن لا تذوب. في ظل هذه الظروف، وهو بروتين الغشاء - المتوفرة في شكل المذيلات البروتين المنظفات - والاندماج في الجسيمات الشحمية وتصبح أعاد في غشاء الحويصلية على إزالة المنظفات، مما أدى إلى proteoliposomes. لإعادة أوبسين (تم الحصول عليها من البروتين النقي في 0.1٪ (ث / ت) DDM)، يتم إعداد LUVs من خليط من POPC (1-بالميتويل-2-oleoyl- التعطيل -glycero-3-phosphocholine) وPOPG (1- بالميتويل-2-oleoyl- التعطيل -glycero-3- [الفوسفات-rac- (1-الجلسرين)]) ومشبعة DDM قبل إضافة أوبسين وبنك دبي الوطني-PC. ثم تتم إزالة المنظفات عن طريق التعامل مع عينة مع الخرز البوليسترين. <html> معشوقة = &quot;jove_content&quot;&gt; ويظهر المبدأ الأساس لفحص القائم على مضان في الشكل 1B. وأعيد LUVs بشكل متناظر مع كمية ضئيلة من بنك دبي الوطني-PC أو غيرها المسمى دبي الوطني، مراسل فوسفورية فلوري (الشكل 1A). على إضافة dithionite، يتم تخفيض على غشاء impermeant dianion، يتم تقديم جزيئات دبي الوطني-PC في النشرة الخارجية للLUVs غير الفلورسنت كما نيترو-مجموعة بنك دبي الوطني إلى الأمينية مجموعة غير الفلورسنت. كما لا الجزيئات دبي الوطني-PC ولا dithionite قادرة على اجتياز الغشاء على المدى الزمني للتجربة (&lt;10 دقيقة)، وهذا يؤدي إلى تخفيض 50٪ من إشارة الفلورسنت. ومع ذلك، إذا تم إعادة تشكيل الجسيمات الشحمية مع scramblase، جزيئات دبي الوطني-PC في النشرة الداخلية يمكن أن يتبارى بسرعة إلى الخارج حيث تقوم بتقليل. وهذا يؤدي إلى فقدان تام للمضان في حالة مثالية (الشكل 1C). وفاق / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg &quot;/&gt; . الشكل 1: تمثيل تخطيطي لفحص النشاط scramblase يستخدم فحص والمسمى دبي الوطني الفلورسنت مراسل الدهنية؛ ويرد دبي الوطني-PC (A). وأعيد الحويصلات unilamellar كبيرة مع كمية ضئيلة من بنك دبي الوطني-PC. إعادة تنتج الحويصلات متماثل، مع بنك دبي الوطني-PC موزعة بالتساوي في منشورات الخارجي والداخلي. Dithionite (S 2 O 4 2-) يقلل كيميائيا نيترو مجموعة بنك دبي الوطني إلى الأمينية مجموعة غير الفلورسنت. علاج الجسيمات الشحمية خالية من البروتين مع dithionite (ب، أعلى) يؤدي إلى تخفيض 50٪ من مضان فقط منذ جزيئات دبي الوطني-PC في النشرة الخارجي يتم تخفيض: تم شحن dithionite سلبا ولا يمكن عبور الغشاء لتتفاعل مع جزيئات دبي الوطني-PC في النشرة الداخلية. العلاج Dithionite من proteoliposomes التي تحتوي على أوبسين (B، أسفل)، أي proteoliposomes-scramblase نشط، والنتائج في فقدان 100٪ من وluorescence كما أوبسين يسهل حركة بنك دبي الوطني-PC بين الداخلية والنشرة الخارجية. (C) ويظهر آثار مضان المثالية الحصول على علاج الجسيمات الشحمية خالية من البروتين وproteoliposomes التي تحتوي على أوبسين مع dithionite. معدل فقدان مضان هو نفسه في الحالتين يشير إلى أن تخفيض الكيميائية دبي الوطني dithionite هو معدل الحد، والتي تسعى جاهدة يحدث بمعدل يساوي أو أكبر من معدل التفاعل الكيميائي. وتظهر آثار الحصول عليها من تجربة الفعلية في الشكل (3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54635/54635fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> الطرق وصفنا يمكن استخدامها لإعادة بناء ومقايسة تنقية البروتينات الأخرى، فضلا عن خليط من البروتينات الغشاء تم الحصول عليها، على سبيل المثال، عن طريق استخراج microsomes ل مع المنظفات 22.

<table><tbody><tr><td>1-بالميتويل -2-أوليويل <م > SN < / م > جلسيرو -3-فوسفوكولين</td><td>أفانتي القطبية الدهون</td><td>850457C</td><td>POPC</td></tr><tr><td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (ملح الصوديوم)Avanti</td> <td>Polar Lipids</td><td>840457C</td><td>POPG</td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1،3-benzoxadiazol-4-yl) أمينو] hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>أفانتي بولر ليبيدات</td><td>810130C</td><td>NBD-PC</td></tr><tr><td>4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك حمض</td><td>VWR Scientific</td><td>EM-5330</td><td>هيبس</td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم</td><td>سيجما</td><td>S7653-1KG</td><td>كلوريد الصوديوم</td></tr><tr><td>دوديسيل-بيتا -D-مالتوسيد</td><td>أناترايس</td><td>D310 5 جم</td><td>DDM</td></tr><tr><td>فلوريمتر كوفيت</td><td>سيجما</td><td>C0918-100EA</td><td>كوفيت</td></tr><tr><td>مقياس الطيف فلوري</td><td>فوتون تكنولوجي إنترناشيونال</td>مقياس <td></td><td>الفلور</td></tr><tr><td>هيدروكبريتيت الصوديوم الصف التقني ، 85٪</td> <td>Sigma</td><td>157953-5G</td><td>dithionite</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5 software</td><td></td><td></td><td>Prism Tris</td></tr><tr><td>Base</td><td>VWR</td><td>JTX171-3</td><td>Tris</td></tr><tr><td>LIPEX 10 ml extruder&nbsp;</td><td>شركة Northern Lipids، Inc.</td><td></td><td>الطارد</td></tr><tr><td>Whatman ، قرص التصريف ، PE ، 25 مم</td><td>Sigma</td><td>28156-243</td><td>دعم القرص</td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Track-Strhed Membranes ، 0.4 & micro ؛ م ، قطر 25 مم</td><td>سيجما</td><td>WHA110607</td><td>غشاء 400 نانومتر</td></tr><tr><td>أغشية Whatman Nucleopore Track-Stred ، 0.2 & micro ؛ م ، قطر 25 مم</td><td>سيجما</td><td>WHA110606</td><td>غشاء</td></tr><tr><td>فوسفات الصوديوم</td><td>Sigma</td><td>S3264-500G</td><td></td></tr><tr><td>VWR أنابيب الثقافة ، يمكن التخلص منها ، زجاج البورسليكات ، 13 × 100 مم</td><td>VWR Scientific</td><td>47729-572</td><td>أنابيب زجاجية حمض</td></tr><tr><td>البيركلوريك</td><td>Sigma</td><td>30755-500ML</td><td></td></tr><tr><td>الأمونيوم موليبدات رباعي الهيدرات</td><td>Sigma</td><td>A-7302</td><td>موليبدات الأمونيوم</td></tr><tr><td>(+) - الصوديوم L-ascorbate</td><td>Sigma</td><td>A7631-25G</td><td>أسكوربات الصوديوم</td></tr><tr><td>Bio-Beads SM2 الماصات</td> Bio <td>Rad</td><td>1523920</td><td>حبات البوليسترين</td></tr> <tr><td>&nbsp ؛ 2.0 مل Microtubes Clear</td><td>VWR Scientific</td><td>10011-742</td><td>إعادة التكوين أنابيب</td></tr><tr><td>إعادة التكوين أنبوب زجاجي</td><td>VWR Scientific</td><td>53283-800</td><td>إعادة تكوين الأنابيب الزجاجية</td></tr><tr><td>Zetasizer &nbsp ؛</td><td>مالفيرن&nbsp;</td><td></td><td>DLS</td></tr></tbody></table>

فحص مضان القائم من الفوسفوليبيدية scramblase آخر

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Scramblases نقل من الدهون الفوسفاتية عبر طبقة ثنائية الغشاء الاتجاهين بطريقة مستقلة اعبي التنس المحترفين. وscramblase الأولى أن يكون تحديد وكيميائيا التحقق وأوبسين، في صميم بروتيني من رودوبسين مبصرة. رودوبسين هو مستقبلات البروتين يقترن-G المحلية في قضيب مبصرة الأغشية القرص من شبكية العين حيث أنها مسؤولة عن إدراك الضوء. النشاط scramblase رودوبسين للا تعتمد على يجند لها 11- رابطة الدول المستقلة -retinal، أي أوبسين صميم بروتيني كما تنشط باعتباره scramblase. على الرغم من التأسيسية وينظم فوسفورية الهرولة تلعب دورا هاما في علم وظائف الأعضاء الخلية، تم التعرف على عدد قليل فقط scramblases فوسفورية حتى الآن إلى جانب أوبسين. نحن هنا وصف مقايسة على أساس مضان النشاط scramblase أوبسين ل. وأعيد أوبسين في الجسيمات الشحمية unilamellar كبيرة تتألف من فسفاتيديل، phosphatidylglycerol وكمية ضئيلة من الفلورسنت وصفت دبي الوطني PC (1-صalmitoyl-2- {6- [7-نيترو-2-1،3-benzoxadiazole-4-YL) الأمينية] hexanoyl} - SN -glycero-3-phosphocholine). يتم تحديد النشاط Scramblase من خلال قياس مدى جزيئات دبي الوطني-PC الموجود في النشرة الداخلية للحويصلة قادرة على الوصول إلى النشرة الخارجية حيث يتم التخلص مضان من كيميائيا من قبل وكيل الحد الذي لا يمكن عبور الغشاء. الطرق وصفنا لها تطبيق عموما، ويمكن استخدامها لتحديد وتوصيف الأنشطة scramblase للبروتينات غشاء الأخرى.

وصفنا إعادة تشكيل أوبسين إلى LUVs لوصف النشاط scramblase وذلك باستخدام مقايسة على أساس مضان. نحن تحليل النتائج لوضع الحد الأدنى لمعدل فوسفورية بوساطة أوبسين الهرولة ولتحديد حالة بلازميدة قليلة القسيمات التي أوبسين reconstitutes وظيفيا إلى الحويصلات. لتحديد شروط إعادة الأمثل، فإنه من الضروري تحديد تجريبيا كمية من المنظفات التي يجب أن تستخدم لتضخيم L...

نصف الاختبار القائم على التألق لقياس تدافع الدهون الفوسفورية في الجسيمات الشحمية أحادية الصفيحة الكبيرة المعاد تشكيلها باستخدام opsin.

فحص مضان القائم من الفوسفوليبيدية Scramblase آخر

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعادة بناء مستقبل نموذجي مقترن بالبروتين G في حويصلات أحادية الطبقة كبيرة، وقياس قدرته على إجراء عملية نقل مستقلة للفوسفوليبيدات عبر طبقة لبيدية مزدوجة باستخدام مقايسة قائمة على الفلورة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال نقل الدهون بين الخلايا، مثل تحديد الهوية الجزيئية للبروتينات التي يمكنها خلط الليبيدات وآلية عملها. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها موثوقة وقوية للغاية.بمجرد تحديد إجراء إعادة التكوين لتركيبة دهنية معينة ومنظف مفضل. لبدء هذا الإجراء، استخدم حقنة زجاجية لإضافة 1435 µL من محلول بتركيز 25 mg/mL من POPC والكلوروفورم إلى دورق مستدير القاعدة. أضف 160 µL من محلول بتركيز 25 mg/mL من POPG والكلوروفورم للحصول على 52.5 µmol من الدهون بنسبة مولارية تبلغ تسعة إلى واحد من POPC إلى POPG.بعد ذلك، يتم تجفيف الدهون لمدة 30 دقيقة باستخدام مبخر دوار مضبوط على 145 RPM. وبمجرد اكتمال التجفيف، تُنقل القارورة إلى مجفف تفريغ لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة. ثم، يتم إضافة 10 milliliters من buffer A لترطيب غشاء الدهون المجفف.قم برج القارورة بلطف حتى يتكون معلق عكر متجانس. قم بمعالجة المعلق بالموجات فوق الصوتية بتردد 40 kilohertz في حمام مائي في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، وباستخدام جهاز البثق، مرر العينة عبر غشاء بحجم مسام 400 nanometer، وذلك 10 مرات.اتبع ذلك بدورة ثانية من البثق، من خلال تمرير العينة عبر غشاء بحجم مسام 200 nanometer، لأربع مرات. اترك المعلق الناتج الأكثر صفاءً بشكل ملحوظ جانباً، والذي يحتوي على حويصلات أحادية الطبقة كبيرة من الفوسفوليبيدات بقطر يبلغ حوالي 175 nanometers. بعد اكتمال عملية البثق، قم بتحضير المعايير في أنابيب زجاجية بحجم 13 by 100 millimeter كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.بعد ذلك، أضف 10 µL من كل عينة من الـ LUV والبروتيلوبوزومات إلى أنبوب زجاجي منفصل، ثم خففها باستخدام 40 µL من الماء المقطر منزوع الأيونات. أضف 300 µL من حمض البيركلوريك إلى كل أنبوب، ثم سخنها لمدة ساعة واحدة عند 145 °C في كتلة تسخين. ضع كرة رخامية على كل أنبوب لمنع التبخر.بعد ذلك، اترك الأنابيب لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة وأضف واحد milliliter من الماء المقطر منزوع الأيونات إلى كل منها. أضف 400 microliters من محلول تم تحضيره حديثاً يحتوي على 12 grams per liter من موليبدات الأمونيوم و 50 grams per liter من أسكوربات الصوديوم إلى كل أنبوب، ثم استخدم جهاز الـ vortex للمزج. سخّن الأنابيب لمدة 10 minutes عند 100 degrees Celsius مع استخدام كرات زجاجية لمنع التبخر.بعد ذلك، قم بإزالة الأنابيب من وحدة التسخين واتركها حتى تبرد لتصل إلى درجة حرارة الغرفة. وباستخدام مقياس الطيف الضوئي المضبوط على 797 nanometers، استخرج منحنى معايرة باستخدام المعايير. ثم قم بقياس الامتصاصية للعينات مقابل العينة الفارغة (blank)، وحدد محتوى الفوسفات.ابدأ بنقل 800 µL من كل معلق LUV مبثوق إلى أنبوب microfuse فريد سعة 2 mL. أضف 5.3 µL من buffer A و 34.7 µL من DDM بتركيز 10% mass-per-volume، المذاب في buffer A، إلى كل أنبوب. بعد ذلك، قم بتحضين العينات لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة مع الخلط بالتدوير المستمر (end-over-end mixing).بينما تخضع العينات للحضن، قم بوزن 400 milligrams لكل عينة من الخرز في بيكر زجاجي. اغسل الخرز باستخدام 5 milliliters لكل عينة من الميثانول، مع التقليب ببطء لمدة 10 دقائق. كرر عملية الغسل هذه مرة واحدة بالميثانول، وثلاث مرات بالماء، ومرة واحدة بـ buffer A. خلال الدقائق الثلاثين الأخيرة من حضن العينات، قم بتجفيف 9.5 microliters لكل عينة من NBD labeled phospholipid في أنبوب زجاجي ذي غطاء لولبي تحت تيار من النيتروجين.بعد ذلك، أضف 45 µL لكل عينة من DDM بتركيز 0.1% w/v في المنظم A لإذابة الفوسفوليبيد المجفف. وبعد اكتمال فترة الحضن، أضف محلول الفوسفوليبيد المسمى MBD المذاب إلى كل عينة. ثم أضف 0.1% DDM، والمنظم A، والأوبسين المذاب في DDM بالكمية المطلوبة، بهذا الترتيب، للحصول على حجم نهائي قدره 1 mL بتركيز 7 mM من DDM.يتم تحقيق إعادة تكوين بروتين غشائي من خلال معالجة الحويصلات بكمية كافية من المنظف بحيث لا يتسبب الانتفاخ في تحللها. وبناءً على هذه الظروف، التي يجب تحديدها تجريبياً لكل تركيبة ليبيدية ومنظف، سيندمج البروتين في الليبوزومات. اخلط العينات لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.بعد ذلك، أضف 80 milligrams من حبيبات البوليسترين المُحضرة إلى كل أنبوب، واحضنها مرة أخرى لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الخلط بطريقة التدوير الطولي (end-over-end mixing). أضف 160 milligrams إضافية من حبيبات البوليسترين إلى كل عينة، واحضنها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع الخلط بطريقة التدوير الطولي. عند اكتمال فترة الحضن، انقل العينات إلى أنابيب زجاجية نظيفة، بحيث تحتوي كل منها على 160 milligrams من الحبيبات الجديدة، مع ترك الحبيبات السابقة في الأنابيب.امزج العينات بالتقليب المستمر (end-over-end) طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C، مع الحماية من الضوء. بعد ذلك، انقل العينات، بدون الخرز، إلى أنابيب microfuse منفصلة. ضع الأنابيب على الثلج استعداداً لمقايسة نشاط السكرامبلاز (scramblase activity assay).ابدأ بإضافة 1950 µL من المنظم A إلى كيوفت بلاستيكية تحتوي على قضيب تحريك بلاستيكي. بعد ذلك، أضف 50 µL من عينة البروتيلبوزوم المحضرة. اترك العينة لتصل إلى حالة التوازن في مطياف الفلوريسنت مع التحريك المستمر لمدة خمس ثوانٍ.بينما تتعادل العينة، قم بتحضير محلول من الديثيونيت بتركيز 1 molar في محلول tris غير منظم بتركيز 0.5 molar. ابدأ مراقبة الفلورة بطول موجي للإثارة يبلغ 470 nanometers، وطول موجي للانبعاث يبلغ 530 nanometers، وعرض شق يبلغ 0.5 nanometers. سجل القراءات لمدة 50 seconds للوصول إلى إشارة مستقرة.بعد ذلك، أضف 40 µL من محلول الديثيونيت بتركيز 1 M إلى الكيوفيت. سجل الفلورية لمدة 500 ثانية على الأقل. وأخيراً، قم بتحليل البيانات كما هو موضح في البروتوكول النصي.لإجراء تحليل كامل لبيانات الفلورة، وذلك لتحديد جزء الحويصلات التي لا يمكن إعادة تشكيلها، وكذلك استعادة البروتينات والليبيدات في الحويصلات المعاد تشكيلها وتوزيع أحجام هذه الحويصلات. في هذه الدراسة، يتم إعادة تشكيل الأوبسين (opsin) في حويصلات أحادية الطبقة كبيرة لتوصيف نشاط السكرامبلاز (scramblase) الخاص به باستخدام مقايسة تعتمد على الفلورة.تُعاد تكوين الحويصلات باستخدام NBD-PC، والذي يتوزع بالتساوي بين الطبقتين الخارجية والداخلية. يقوم الديثيونيت باختزال مجموعة النيترو في NBD الموجودة على السطح الخارجي للحويصلة إلى مجموعات أمينية غير فلورية، مما يؤدي إلى انخفاض بنسبة 50% في الفلورة في الليبوزومات الخالية من البروتين. ومع ذلك، عندما يسهل الأوبسين حركة NBD بين الطبقتين الداخلية والخارجية، يحدث فقدان كامل للفلورة.يمكن رؤية النتائج التمثيلية لهذا النهج عند نسب مختلفة من البروتين إلى الفسفوليبيد هنا. يزداد مدى انخفاض الفلورية مع زيادة كمية الأوبسين المعاد تشكيله في الحويصلات، والتي تتراوح من صفر إلى 4.95 micrograms. تمت إضافة الديثيونيت في الوقت المحدد، وتمت مراقبة فلورية NBD لمدة 400 ثوانٍ.يكون انخفاض الفلورة أكثر أهمية عند نسب البروتين إلى الفسفوليبيد الأعلى، حيث بلغ أكبر انخفاض 85%. ثم يُستخدم انخفاض الفلورة النهائي لتحديد احتمالية نشاط السكرامبلاز، واحتمالية احتواء الحويصلات على سكرامبلاز واحد على الأقل باستخدام إحصائيات Polson. يمثل المنحنى الأحمر ملاءمة أحادية الأسية لبروتين الأوبسين. بينما تمثل الخطوط الرمادية المتقطعة ملاءمات أحادية الأسية لإعادة بناء الأوبسين في الحويصلات كـ مونومرات، أو ديمرات مسبقة التكوين، أو تيتامرات مسبقة التكوين.يمكن تكييف الطريقة التي نصفها بسهولة لتلبي احتياجات مختلفة. وتتميز هذه الإجراءات بتعدد استخداماتها، حيث يمكن توظيفها في المستقبل لتحديد وتوصيف نشاط سكرامبلاز الفوسفوليبيد (phospholipid scramblase) لبروتينات غشائية أخرى. كما يمكن تطبيق إجراء إعادة التشكيل على أي بروتين غشائي.مكّنتنا هذه التقنية من تحديد أوبسين (opsin) كأول إنزيم لتبديل الفوسفوليبيدات (phospholipid scramblase) تم التحقق منه كيميائياً حيوياً، وهو ما أتاح لنا لاحقاً توصيف نشاط حالات التشكيل المختلفة للبروتين، وقدرته على نقل ليبيدات مختلفة.

a-fluorescence-based-assay-of-phospholipid-scramblase-activity

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

نحن نقدم سريع مضان مقايسة على أساس أن يراقب معدل التبريد مضان كمقياس للنشاط قناة غراميسيدين. وتستخدم القنوات غراميسيدين ومحولات القوة الجزيئية لمراقبة التغيرات في خصائص طبقة ثنائية المادة الدهنية كما لمست من البروتينات التي تغطي طبقة ثنائية.

غراميسيدين القائم على الفحص الإسفار ؛ لتحديد الجزيئات الصغيرة المحتملة لتعديل خصائص طبقة ثنائية الدهن

لاختبار مدى تفاعل البروتين الدهني مع هدفها كنا MACS وAnnexin V - مترافق الخرز المغناطيسي وحويصلات الدهنية من الدهون المركبة المستهدفة وAnnexin فسفاتيديل V - ملزمة. هي بروتينات الدهنية منضم إلى الهدف المشترك تنقيتها وتحليلها بعد شطف من الخرز.

الكروماتوجراف الدهون تقارب الحويصلة بوساطة الفرز المغناطيسي باستخدام خلية المنشط (LIMACS) : طريقة جديدة لتحليل البروتين الدهني التفاعل

يناقش هذا الفيديو مقايسة تسرب التألق لدراسة تفاعلات الببتيدات المخترقة للخلايا مع أغشية الخلايا باستخدام تقليد غشاء الخلية - حويصلات أحادية الصفيحة الكبيرة ، أو LUVs ، مغلفة بصبغة فلورية ومروية.

مقايسة تسرب التألق لدراسة تفاعل الببتيد المخترق للخلايا مع الغشاء

في هذا الفيديو ، نوضح تفاعلات البروتين والفوسفوينوسيتيد في نمط ميكروسويديك باستخدام مقايسة تعديل الأس الهيدروجيني ، باستخدام صبغة الفلورسنت الحساسة للأس الهيدروجيني الموسومة بالدهون الفوسفاتيديلة إيثانولامين لطبقة ثنائية الدهون المدعومة ، تسمى منصة الموائع الدقيقة. تتسبب التعديلات في الأس الهيدروجيني بعد ارتباط البروتين بالفوسفوليبيد في تبريد التألق.

مقايسة تعديل الأس الهيدروجيني على الطبقات الدهنية الثنائية المدعومة للكشف عن تفاعلات البروتين والفوسفوينوزيتيد

نقدم تقنية جديدة لقياس الانتشار الجانبي للأنواع النشطة السطحية في واجهة السائل السائل عن طريق دمج طبقة أحادية القطرة في طبقة أحادية مسطحة.

مضان الانتعاش بعد دمج قطرات لقياس انتشار ثنائي الأبعاد من الفوسفوليبيدية واحد رقائق

PI (4،5) ف 2 تنظم مختلف الوظائف الخلوية، ولكن من المفهوم منظمة النانوية في غشاء الخلية البلازما سيئة. بوصف PI (4،5) ف 2 مع التحقيق الذي تجريه الفلورسنت ثنائي اللون تنصهر إلى المجال Pleckstrin التماثل، ونحن تصف نهجا جديدا لدراسة PI (4،5) ف 2 التوزيع المكاني في غشاء البلازما على مقياس متناهي الصغر .

جزيء واحدة سوبر قرار تصوير فوسفتيدلينوستول 4،5-bisphosphate في غشاء البلازما مع رواية المسابر نيون

هنا نقدم طبقة ثنائية الدهون المدعومة في سياق منصة ميكروفلويديك لدراسة التفاعلات البروتين فسفوانوسيتيد باستخدام طريقة خالية من التسمية على أساس التشكيل الرقم الهيدروجيني.

بيب على رقاقة: دراسة خالية من التسمية من التفاعلات البروتين فسفوانوسيتيد

يصف هذا البروتوكول تلفيق الجسيمات الشحمية وكيف يمكن ان يتم تعبئتها علي سطح وبشكل فردي بطريقه متوازية ضخمه باستخدام المجهر الفلوري. وهذا يسمح للقياس الكمي للحجم والتجانس التركيبي بين الدهنيات واحد من السكان.

A الكمي الفلورية المجهري القائم علي فحص ليبوسوم واحد للكشف عن التجانس التركيبي بين الجسيمات الشحمية الفردية

إن المقايسة الفلورية للتسرب هي طريقة بسيطة تمكن من التحقيق في تفاعلات الببتيد / الغشاء من أجل فهم مشاركتها في العديد من العمليات البيولوجية وخاصة قدرة الببتيدات المخترقة للخلايا على إزعاج الطبقات الثنائية الفوسفوليبيدات أثناء عملية نقل خلوية مباشرة.

فحص التسرب الفلوري للتحقيق في زعزعة استقرار الغشاء عن طريق الببتيد المخترق للخلايا

هنا، ونحن نصف بروتوكولات باستخدام أجهزة استشعار الدهون الفلورية والدهون لتحديد ما إذا كان البروتين مقتطفات وينقل فوسفاتيديلسيرين أو فوسفاتيديلينوزيتول 4-فوسفات في المختبر.

القياسات القائمة على الفلورسينس من فوسفاتيديلسيرين / فوسفاتيديلينوزيتول 4-تبادل الفوسفات بين الأغشية

نقدم طريقة فعالة من حيث التكلفة لتقييم نفاذية الغشاء الشحمي بحساسية ودقة فائقة على التقنيات التقليدية. باستخدام تفاعل استبدال الترابط المغلف الجديد ، تكتشف هذه التقنية التغيرات المستحثة عن الفوسفوليباز A2 في أغشية النموذج. يتكامل هذا النهج الذي يمكن الوصول إليه بسهولة مع التحليلات القياسية ، ويعزز الدقة لدراسة الفيزياء الحيوية للغشاء وتفاعلات السموم.

مقايسة نفاذية غشاء الجسيمات الشحمية للتحقيق في آثار مجموعات فوسفات فوسفاتيديلينوسيتول على عمل membranotropic للسم PLA2

اكتشف طريقة فحص مضان الفوسفوليبيدات في الحويصلات الدهنية الكبيرة باستخدام الأوبسين لفهم آليات نقل الدهون بين الخلايا. هذه التقنية موثوقة وقوية لدراسة ديناميكيات الدهون.

فحص مضان القائم من الفوسفوليبيدية Scramblase آخر

استكشف المزيد من الفيديوهات