تباين الخواص مضان كأداة لدراسة التفاعلات البروتين البروتين

تفاعلات البروتين هي في صميم وظيفة الخلية. وتستخدم تقنيات مقياس الكالوري والطيفية عادة لوصف لهم. نحن هنا وصف تباين مضان كأداة لدراسة التفاعل بين البروتين تحور في متلازمة شوان دايموند (SBDS) والاستطالة عامل مثل 1 GTPase (EFL1).

الهدف العام من هذه التجربة هو تقييم وتحديد التفاعل بين بروتينين مهمين باستخدام تباين الخواص الفلورية. يمكن أن تساعد هذه التدابير في الإجابة على الأسئلة الرئيسية. مجال الكيمياء الحيوية للبروتين والفيزياء الحيوية للبروتين ، مثل البروتين الذي تكون تفاعلاته مهمة للوظيفة الخلوية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا الحصول على معلومات كمية ونوعية حول تفاعل البروتين والبروتين. لتحضير بروتين SBDS-FlAsH المنقى ، قم أولا بإعداد لتر واحد من الوسط السائل LB المكمل ب 100 ميكروغرام لكل مليلتر أمبيسلين. وفي ذلك ، حولت الثقافة البكتيريا عند 37 درجة مئوية حتى تصل الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر إلى 0.5 إلى 0.7.

تحفيز التعبير عن بروتين SBDS-FlAsH عن طريق إضافة 0.5 مللي مولار IPTG إلى المزرعة واستمر في الحضانة لمدة خمس ساعات أخرى. بعد ذلك ، اجمع المعلق البكتيري عن طريق الطرد المركزي عند 3800 مرة جم لمدة عشر دقائق عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية.

أعد تعليق الخلايا في 35 مل من زبدة تحلل SBDS مكملة بواحد مللي مولو PMSF. Lyse عن طريق الصوتنة لمدة أربع دقائق باستخدام دورات من عشر ثوان و 30 ثانية عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 9 ، 000 مرة G لمدة 50 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

احتفظ بالمادة الطافية وتخلص من اللوحة لإزالة الحطام الخلوي. بعد موازنة عمود تقارب النيكل بثلاثة أحجام أعمدة من المخزن المؤقت لتحلل SBDS ، أدخل المادة الطافية الموضحة بالكامل على العمود. قم بإزالة البروتين غير المرتبط عن طريق الغسيل بثلاثة أحجام أعمدة من المخزن المؤقت لتحلل SBDS.

بعد غسل العمود ، قم بمسح البروتين المرتبط بثلاثة أحجام أعمدة من المخزن المؤقت لشطف SBDS. لمزيد من تنقية البروتين ، قم بموازنة عمود مبادل كاتيون السلفوبروبيل بثلاثة أحجام أعمدة من المخزن المؤقت لعمود S منخفض الملح. قم بتخفيف البروتين ستة أضعاف باستخدام 50 مللي مولار من الفوسفات المخزن المؤقت PH 6.5 وأدخله إلى العمود.

اغسل المادة غير المنضمة بثلاثة أحجام أعمدة من المخزن المؤقت للعمود منخفض الملح. بعد ذلك ، قم بتخطيص البروتين في خطوة واحدة عن طريق إضافة 50 مللي مولار من الفوسفات المخزن المؤقت PH 6.5 ، كلوريد الصوديوم المولي على العمود. خفف المصفف ثلاثة أضعاف باستخدام 50 مللي مولار فوسفات عازلة PH 6.5.

بعد ذلك ، قم بتركيز البروتين بأجهزة الترشيح الفائق عن طريق الطرد المركزي عند 3800 مرة جم لمدة خمس عشرة دقيقة. جودة البروتينات المستخدمة في هذا النوع من التجارب قوية للغاية. يصبح تفسير البيانات معقدا إذا لم تكن عينات البروتين المستخدمة عالية النقاء.

تحقق من نقاء بروتين SBDS-FlAsH عن طريق تحليل SDS-PAGE وتلوين Coomassie. قم بتجميد البروتين في النيتروجين السائل وتخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام الآخر. لتحضير بروتين EFL1 المنقى ، تم تحويل الخميرة الأولى عند 30 درجة مئوية في لتر واحد من وسط التسرب الاصطناعي بدون اليوراسيل ، مع استكمال 0.5 في المائة من الجلوكوز حتى تصل الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر إلى 1.8.

تحفيز التعبير عن البروتين عن طريق إضافة 2.8 في المائة من الجالاكتوز إلى المزرعة واستمر في الحضانة لمدة 18 ساعة عند 30 درجة مئوية. اجمع تعليق الخميرة عن طريق الطرد المركزي عند 3800 مرة G لمدة عشر دقائق عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية بعد الطرد المركزي.

أعد تعليق الخلايا في 50 مل من محلول تحلل EFL1 مكمل بواحد مليمولي مولي PMSF وواحد مليمولار بنزامدين. قم بتعطيل الخلايا عن طريق الاحتكاك على مضرب الخرز باستخدام الخرز الزجاجي لمدة إجمالية قدرها ست دقائق باستخدام دورات مدتها دقيقتان وخمس عشرة دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 9 ، 000 مرة G لمدة 50 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

احتفظ بالمادة الطافية وتخلص من الحنك لإزالة الحطام الخلوي. بعد ذلك ، قم بموازنة عمود تقارب النيكل بثلاثة أحجام أعمدة من المخزن المؤقت لتحلل EFL1. أدخل كل المادة الطافية الموضحة على العمود المتوازن.

بعد إزالة البروتين غير المرتبط عن طريق غسل العمود بثلاثة أحجام أعمدة من المخزن المؤقت لتحلل EFL1 ، قم بإزالة البروتين المرتبط بثلاثة أحجام أعمدة من المخزن المؤقت لشطف EFL1. لمزيد من تنقية بروتين EFL1 ، قم بموازنة عمود استبعاد الحجم مع 1.5 وحدة تخزين من المخزن المؤقت لتباين الخواص. قم بتركيز بروتين EFL1 المراوغ من عمود تقارب النيكل إلى مليلتر واحد باستخدام أجهزة الترشيح الفائق عن طريق الطرد المركزي عند 3800 مرة G. ثم أدخل العينة المركزة في عمود استبعاد الحجم.

اجمع البروتين المراوغ وركزه عن طريق الترشيح الفائق إلى تركيز نهائي يبلغ حوالي 30 ميكرومولار. تحقق من نقاء بروتين EFL1 عن طريق تحليل SDS-PAGE وتلوين Coomassie. قم بتجميد البروتين في النيتروجين السائل وتخزينه في درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام الآخر.

امزج ثلاثة نانومول من بروتين SBDS-FlAsH مع ثلاثة نانومول من صبغة lumio الخضراء في حجم خمسة ميكرومتر من المخزن المؤقت لتباين الخواص. دع التفاعل يستمر لمدة ثماني ساعات عند أربع درجات مئوية. بعد ثماني ساعات ، قم بغسيل الكلى للعينة مقابل المخزن المؤقت لتباين الخواص طوال الليل لإزالة الصبغة الحرة.

قم بقياس المواد الماصة عند 280 نانومتر و 508 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي باستخدام كوفيت الكوارتز. بعد ذلك ، استخدم قانون لامبرت بير لتحديد النسبة المئوية للبروتين المسمى كما هو موضح في بروتوكول النص. قبل قياس قيمة تباين الضمور ، يجب أن تتم كل خطوة ترشيح من فيلق البروتين بعناية ، مما يضمن توزيع العينة بأكملها في المحلول وتصبح متجانسة.

في كوفيت مضان ، ضع 200 ميكرولتر من 30 نانومولار SBDS-FlAsH في مخزن مؤقت متمزم وقم بمعايرة ميكرولترين من 30 ميكرومولار EFL1. تخلط جيدا ، واترك التفاعل يقف لمدة ثلاث دقائق قبل قياس قيمة التذوق والتألق. كرر هذه العملية حتى يتم إضافة حجم إجمالي قدره 40 ميكرولتر من EFL1.

كخطوة أخيرة ، قم بملاءمة البيانات مع نموذج ملزم مفترض كما هو موضح في بروتوكول النص. لإجراء أي تجربة متمزوجة ، من المهم استبعاد التغييرات الكبيرة في شدة التألق. كما هو موضح هنا ، لا يتغير تألق SBDS-FlAsH بشكل ملحوظ عند الارتباط ب EFL1.

يؤدي معايرة EFL1 إلى كوفيت كوارتز يحتوي على SBDS-FlAsH إلى زيادة تباين التغذية الأولي المرصود. تصف العديد من الإضافات من EFL1 منحنى الربط المقابل الذي يمكن أن يكون مناسبا باستخدام انحدار المربعات الصغرى غير الخطية إلى نموذج ربط مفترض. في هذه الحالة ، لا يصف نموذج موقع ربط واحد البيانات التجريبية بشكل مناسب.

بدلا من ذلك ، يصف نموذج موقعي الربط غير المتطابقين البيانات التجريبية بشكل مناسب. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تجربة ربط التضخم المضان في غضون ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن يكون لديك بروتين منقى بكميات كبيرة.

بالتوازي مع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل هذه مع مقايسة التكميل المستندة إلى الشظايا ، أو تباين التألق مع مجالات مختلفة من البروتين المدروس من أجل دعم نموذج الربط المناسب. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تجربة ملزمة متبوعة بضمور الفلورة.