مضان تنشيط الفرز الخليوي لتنقية الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل من الفأر نخاع العظم

الهدف العام من هذه التجربة هو عزل الخلايا المتغصنة البلازمية ، أو PDC ، بدرجة نقاء عالية من نخاع عظم الفئران المعرضة للذئبة لدراسة وظيفتها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بخصائص مجموعة معينة من الخلايا المناعية ، مثل الإنترفيرون ألفا الذي ينتج PDC خلال المرحلة المتأخرة من تطور الذئبة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إثراء واحد إلى عدة مجموعات مستهدفة إلى نقاء أعلى من الفرز المغناطيسي.

بعد الحصاد ، انقل عظام الأطراف الخلفية وأربعة ملليلتر من الوسط الكامل ، إلى هاون. أضف ستة ملليلتر من الوسط الكامل الطازج ليصل الحجم الإجمالي إلى 10 ملليلتر. وكسر العظام برفق باستخدام مدقة.

حرك المدقة برفق لتحرير نخاع العظام. بعد ذلك ، انقل كل الوسط من خلال مصفاة 70 ميكرون إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر على الجليد. أضف 10 مل من الوسط الكامل الطازج إلى الهاون.

وقم بتصفية المادة الطافية مرتين أخريين حتى تظهر العظام بيضاء. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لخلايا نخاع العظام ، وأعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من الوسط الكامل الطازج. بعد ذلك ، ضع طبقة من الخلايا على خمسة ملليلتر من وسط التدرج الكثيف المحضر حديثا في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر ، مع الحرص على عدم تعطيل الطبقات.

وفصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي. بعد ذلك ، قم بإزالة أعلى ثمانية ملليلتر من المحلول بعناية ، واجمع طبقة مليتر من المليتر في الطور البيني. أضف 12 مل من الوسط الكامل المثلج إلى الخلايا أحادية النواة المعزولة ، وقم بتغطية الأنبوب للخلط عن طريق الانعكاس.

ثم ، قم بتقطيع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. لتلطيخ الخلايا ل FACS ، أعد تعليقها في 100 ميكرولتر من الجسم المضاد CD1632FC الذي يمنع عند أربع درجات مئوية. بعد 10 دقائق ، اغسل الخلايا في أربعة ملليلتر من عازلة الفرز المثلجة وقم بتسمية الخلايا ب 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة المناسب لتلوين سطح الخلية.

لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية في الظلام. اغسل الخلايا في أربعة ملليلتر من محلول الفرز البارد لإزالة أي جسم مضاد مترافق غير مرتبط. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من محلول تحميل FACS وانقل العينة إلى أنبوب FACS على الجليد.

لتلطيخ عناصر التحكم في التعويض ، قم بتقطيع 10 إلى سادس من خلايا الطحال لكل أنبوب. اغسل الخلايا بأربعة ملليلتر من عازلة الفرز وأعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من عازلة الفرز. بعد ذلك ، أضف الجسم المضاد المترافق الفلوري المناسب من كوكتيل الجسم المضاد لسطح الخلية الرئيسية إلى كل أنبوب تعويض مقابل وقم بهز الأنابيب للخلط.

بعد 15 دقيقة في الظلام ، عند أربع درجات مئوية ، اغسل جميع العينات باستخدام عازل الفرز وأعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من محلول الفرز المثلج. باستثناء أنبوب DAPI ، الذي يتم إعادة تعليقه في 500 ميكرولتر من محلول تحميل FACS. لتنقية مجموعة الخلايا المستهدفة عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة ، يتم تجميع الأحمال التي تحتوي على 500 ميكرولتر من FBS مكملة بالمضادات الحيوية أسفل صمامات الفرز.

بعد ذلك ، قم بتحميل الأنبوب غير الملوثة واجمع 10،000 حدث لتعيين البوابة السالبة لكل شدة فلورسنت. و 10 ، 000 حدث في أنابيب تعويض البقعة المفردة لضبط البوابة الموجبة لكل شدة فلورسنت. اجمع 3,000 حدث من العينة التجريبية لتعيين بوابات مجموعة الخلايا التي تم فرزها.

استخدام شدة التألق كمعلمات الرسم البياني للوصول X و Y لبوابة مجموعة الخلايا المستهدفة يدويا. ثم قم بفرز مجموعة الخلايا المستهدفة في أنبوب التجميع. في نهاية الفرز ، أضف ما يصل إلى أربعة ملليلتر من الكرنب الجليدي المتوسط الكامل إلى الخلايا.

ثم قم بتغطية الأنبوب وخلط الخلايا عن طريق الانعكاس. قم بحفر الخلايا المنقاة عن طريق الطرد المركزي ، مع شفط كل ما عدا آخر 200 ميكرولتر من المادة الطافية بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من الوسط الكامل البارد المثلج وانقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر لجهاز طرد مركزي ثان.

أخيرا ، استنشق كل ما عدا آخر 100 ميكرولتر من المادة الطافية وقم بتخزين الخلايا المصنفة على الجليد حتى الاستخدام. ينتج عن فرز الخلايا المنشطة المغناطيسية للخلايا المتغصنة البلازمية لنخاع العظم من الفئران المعرضة للذئبة نقاء 7.75٪ فقط بعد التخصيب. ومع ذلك ، تظهر الخلايا المتغصنة البلازمية المخصبة بنظام FACS نقاء يصل إلى 96.4٪ بعد الفرز.

لضمان نقاء عال ، يتم أولا بوابات خلايا نخاع العظم أحادية النواة وفصلها عن الحطام بواسطة معلمات التشتت الأمامية والجانبية. باستخدام عرض التشتت الأمامي مقابل ارتفاع التشتت الأمامي وعرض التشتت الجانبي مقابل ارتفاع التشتت الجانبي ، يتم بوابات الخلايا المفردة لتجنب الإشارات الإيجابية الخاطئة التي تنتجها المجاميع. ثم يتم بوابات الخلايا السالبة الحية DAPI من خلال تعبير سطح الخلية الإيجابي CD11c ، CD11B السلبي ، مما يسمح بمزيد من البوابات لمجموعة الخلايا المتغصنة المستهدفة الإيجابية لنخاع العظم الإيجابي PDCA-1.

مجموعة PDC التي تم فرزها ليست فقط ذات نقاء عال ولكنها أيضا طبيعية وظيفيا مع القدرة على إنتاج IFNalpha عند تحفيز CPG في المختبر. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تكسير العظام وتقليب نخاع العظم المنبعث برفق للحفاظ على بقاء الخلية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أو الثقافة والتحفيز في المختبر ، للإجابة على أسئلة إضافية حول التعبير الجيني أو وظيفة مجموعات الخلايا المخصبة.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق لباحثي PDC لاستكشاف دور هذه الخلية القوية في تطوير نماذج الفئران المعرضة للذئبة والذئبة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل مجموعة PDC عالية النقاء عن نخاع العظام للفئران المعرضة للذئبة.