Name: تصور المراحل المبكرة من البلعمة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: تعلم تصور مراحل البلعمة المبكرة باستخدام المجهر المكافئ الضوئي لمراقبة تفاعلات المضيف مع المسببات المرضية مثل Candida albicans. هذه الطريقة البسيطة تتيح تحليلاً حساساً للوقت.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر ويندي السلمون ونيكي واتسون للمنشأة كيك في معهد وايتهيد من معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا للتصوير.

1. إعداد خطوط 264.7 خلية DC2.4 و RAW ملاحظة: خط الخلية مثل بلعم RAW 264.7 وشجيري DC2.4 خط الخلية على حد سواء أصل الفئران، واستخدمت الشروط التالية لزراعة الخلايا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخام 264.7 الخلايا في DMEM (الحد الأدنى المتوسطة النسر Dulbecco و) تستكمل مع 10٪ المعطل الجنين مصل بقري (FBS) عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة خلايا DC2.4 في ظروف مماثلة مع أن من الخام 264.7 الخلايا، باستثناء استخدام المتوسطة RPMI (معهد روزويل بارك التذكاري) تستكمل مع L-الجلوتامين بدلا من DMEM. </li></ol> 2. إعداد نيون مترافق الجسيمات: الخرز جيم البيض، زيموزان، مفتش المغلفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزايد المبيضات البيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم C. المبيضة البيضاء سلالة SC5314 من المخزون الجلسرين المجمدة في 25 مل من YPD تستكمل مع أوري (2٪ Bacto-ببتون، 1٪خلاصة الخميرة، 2٪ الجلوكوز و 80 ميكروغرام / مل يوريدين) بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. ملاحظة: تجنب تنامي ثقافة المبيضات أكثر من OD 600 من 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ 1 مل من C. المبيضة البيضاء وتدور عليه في 2000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف وإعادة تعليق بيليه مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع بيليه بواسطة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 2.1.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من C. المبيضة البيضاء فيما يتعلق بعدد الخلايا البالعة والمضي قدما في فحص البلعمة كما هو موضح في القسم 3. إن OD 600 من 1 ما يعادل 2.5 × 10 7 المبيضات البيض في 1 مل. ووصف جيل من المبيضات، حزب الحرية، في اشارة 13: ملاحظة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد زيموزان والخرز المغلفة مفتش- ملاحظة: زيموزان هو β-جلوكان التي تحتوي علىالفطرية إعداد الكربوهيدرات الجسيمات تلك المستمدة من خميرة الخباز. ومن المعروف زيموزان لاستحضار إشارات التهاب في الضامة والخلايا الجذعية، واستخدمت على نطاق واسع في الدراسات البلعمة 13 و 14 و 15. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة وجيزة دوامة الأنبوب الذي يحتوي على جسيمات، وقسامة، وهو مبلغ كاف لتجربة في أنبوب 1.5 مل. ملاحظة: عادة نستخدم 01:10 نسبة (لخلية واحدة، إضافة 10 الجسيمات زيموزان أو حبات مغلفة مفتش). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من الجليد PBS الباردة، وجمع الجزيئات بواسطة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 10000 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف و resuspend بيليه في برنامج تلفزيوني 1 مل الجليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 2.2.2-2.2.3 ملاحظة: انتقل إلى الخطوة 2.2.5 أو تخزين أنبوب في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن الجسيمات لمدة 10 ثانية في sonicator حمام بالموجات فوق الصوتية (120 V، 50-60 كيلو هرتز) وذلك لتجنبنيويورك الجسيمات التجميع. </li></ol></li></ol> 3. البلعمة ملاحظة: البلعمة هي عملية معقدة تبدأ مع ربط جزيئات على سطح خلية من الخلايا البالعة من خلال تفاعل PRRs مع بروابط على سطح الجسيمات. ويتبع ملزمة من قبل الجمعية العامة للالأكتين والبروتينات المرتبطة بها في موقع التماس، وتشكيل كوب البلعمة. يحدث التفكيك الأكتين لاحق في يبلوع والنتائج في الإحاطة الكاملة للجسيمات. أدناه وصفنا مختلف مراحل البلعمة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملزمة الفحص ملاحظة: إن الغرض من هذه التجربة لمراقبة الخطوة الأولى من البلعمة التي تنطوي على التفاعل بين بروابط على الجزيئات المستهدفة والمستقبلات على البالعات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور حوالي 5 × 10 4 خلايا في شريحة الغرفة بحيث تكون 60-70٪ متكدسة في وقت التجربة. Alternatively، وخلايا لوحة على زلات غطاء (في 24- أو شكل 12 أيضا) أو لوحات 96-جيدا أسفل الزجاج. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2. يمكن عدها الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو تقنية مشابهة: ملاحظة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشريحة الغرفة (أو لوحة) في 10 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بلطف المتوسطة من كل بئر باستخدام ماصة أو الشافطة. تنبيه: تنفيذ هذه الخطوة بعناية حيث أن كل بئر من نظام ساترة غرف صغيرة. فمن السهل أن التشويش على الخلايا مع غيض من ماصة أو تيار قوي من الشافطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج من الجسيمات fluorescently المسمى مع خلية ثقافة المتوسط ​​(أعد كما هو موضح أعلاه). إضافة المبيضات -BFP (في وزارة الداخلية من 10)، fluorescently مترافق-زيموزان أو اللاتكس الخرز أرنب مفتش-FITC (10 جسيمات لكل خلية) إلى الخلايا. استخدام الحجم النهائي من 200 ميكرولتر وسائل الاعلام لغرفة واحدة كذلك لضمان تغطية جميع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار الشريحة غرفة في 277x ج لمدة 3 دقائق في 10 درجة مئوية. ملاحظة: هذه الخطوة الطرد المركزي يساعد على زيادة الاتصال بين الجسيمات والخلايا، وذلك بالتزامن عملية الربط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الفور نقل الشريحة غرفة إلى حاضنة ترطيب 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشريحة الغرفة من الحاضنة ونضح وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا 3X مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني. ملاحظة: تحقق من وجود جزيئات غير منضم مع مجهر الضوء وغسل أكثر من مرة مع برنامج تلفزيوني إذا لزم الأمر. ومن الضروري إزالة الجزيئات غير منضم من البئر للحد من الضوضاء الخلفية أثناء التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا بإضافة 500 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) المخفف في برنامج تلفزيوني التي يحتضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تنبيه: هذه الخطوة يتطلب استخدام PFA 4٪ وهي عالية السمية، تآكل، ومادة مسرطنة محتملة. وينبغي اتخاذ الحذر المناسب عند استخدام هذا السائل. أيضا، حماية عينات من الضوء. </li><li&gt; غسل الخلايا بإضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في غرفة ونضح الحل بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر 3.1.9 الخطوة مرتين. ملاحظة: في هذه الخطوة، إعادة ملء القنينة الواحدة فورا بعد إزالة برنامج تلفزيوني السابق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف التثبيت التي يحتضنها مع 500 ميكرولتر من 50 ملي NH 4 الكلورين في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح في الخطوة 3.1.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize الخلايا بإضافة 250 ميكرولتر العازلة ملزمة (0.1٪ سابونين، 0.2٪ في جيش صرب البوسنة PBS) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار F-الأكتين عن طريق إضافة phalloidin مترافق fluorescently (المخفف 1: 500 في المخزن ملزمة). احتضان الخلايا لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح في الخطوة 3.1.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الصور باستخدام المجهر متحد البؤر (الهدف 63X، و 402 نانومتر و 488 نانومتر ليزر) وتحليل الصور باستخدام يماغيج 16. ملاحظة: الجسيمات الناجح يتميز ملزمة من قبل وجود مكعب أكلةp في الموقع حيث الاتصال الجسيمات الخلية البلعمية (الشكل 1). راجع الخطوة 3.2.5. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البلعمة امتصاص الفحص ملاحظة: تم تصميم هذه التجربة لمراقبة استيعاب كامل من الجسيمات التي fluorescently المسمى البالعات باستخدام المجهر متحد البؤر (الشكل 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور حوالي 5 × 10 4 خلايا في شريحة الغرفة بحيث تكون 60-70٪ متكدسة في وقت التجربة. بدلا من ذلك، وخلايا لوحة على زلات غطاء (في 24- أو شكل 12 أيضا) أو لوحات 96-جيدا أسفل الزجاج. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2. يمكن عدها الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو تقنية مشابهة: ملاحظة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الشرائح غرفة (أو لوحة) في 10 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: التبريد هو ضروري من أجل منع الإلتقام وكذلك البلعمة غير المرغوب فيها، وبعد ذلك الحصول على البلعمة متزامنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأداء الإقتصادي الأداءخطوات مكتب إدارة السجلات من 3.1.3 إلى 3.1.5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشريحة الغرفة إلى 37 درجة مئوية حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2، واحتضان للحصول على نقاط زمنية مختلفة. إصلاح الخلايا بعد الإصابة 30، 60 و 90 دقيقة بعد. مراقبة جيم البيض تبدأ في تشكيل خيوط في آخر إصابة 60 دقيقة. تبدأ الخلايا البالعة لإظهار موت الخلايا (pyroptosis) بعد 90 دقيقة 8. ملاحظة: هذا هو التوصية، والأمثل هو ضروري اعتمادا على نوع من الخلايا والجسيمات المستخدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ الخطوات من 3.1.7 إلى 3.1.15. تحليل الصور باستخدام يماغيج 16. ملاحظة: تتميز امتصاص الناجحة التي قام بها لاستيعاب كامل من الجسيمات داخل السيتوبلازم من بلعمية (الشكل 2). تلطيخ الخلايا البالعة مع علامة سطح الخلية مثل phalloidin يساعد على رسم كفاف من الخلايا. ومن الضروري لأداء ض أكوام من أجل أيضا لتحديد ما إذا كان لا بد من الجسيمات إلى سطح الخلية أو مجمعات للالمنضوية etely. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصوير لايف البلعمة ملاحظة: في هذا البروتوكول وصفنا استخدام الميكروسكوب متحد البؤر لالتقاط مختلف مراحل البلعمة باستخدام زيموزان مترافق fluorescently. نحن نستخدم خط الخلية شجيري DC2.4 التي تعبر عن مستقر الموسومة mCherry-F-الأكتين 8، جهاز الاستشعار البيولوجي الذي يظهر توزيع الأكتين الخيطية في الخلايا الحية. منذ البلعمة هي عملية يحركها الأكتين والتصوير الحي في هذه الخلية تمكن ليس فقط لنا لالتقاط حركة وديناميكية الشبكة F-أكتين، ولكن أيضا لتصور أحداث مختلفة أكلة داخل الخلايا الحية (الشكل 3، فيلم 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور حوالي 5 × 10 4 خلايا في شريحة غرفة بتركيز بحيث تكون 60-70٪ متكدسة في وقت التجربة. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2. يمكن عدها الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو ملاحظة:تقنية مماثلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الشرائح غرفة على الجليد لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: التبريد هو ضروري من أجل منع امتصاص غير المرغوب فيها، والحصول على البلعمة متزامنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ الخطوات من 3.1.3 إلى 3.1.5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تدفئة المرحلة المجهر إلى 37 درجة مئوية، وتتوازن الغرفة مع 5٪ CO 2. الانتظار 30-45 دقيقة لدرجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون 2 في الاستقرار قبل بدء التصوير. ملاحظة: منذ CO 2 ودرجة الحرارة مستويات بالغة الأهمية بالنسبة لالبلعمة، فمن المهم لتشغيل سخان المجهر قبل التجربة لكي تتوازن الغرفة البيئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشريحة غرفة تحتوي على خلايا في العلبة المجهر حاضنة معايرتها عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء التصوير الحي 17 و 18. ملاحظة: إعدادات لقوة الليزر (ربح، الثقب، وما إلى ذلك) يمكن أن تختلف تبعا لنوع من الالبريد المجهر والتحقيق الفلورسنت استخدامها. ولذلك، فإننا نوصي التشاور دليل المجهر للحالة المثلى لتصوير حي لديك 17،18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام متحد البؤر مجهر المسح الضوئي ليزر (والبرامج المرتبطة بها) لتصوير حي. استخدام الهدف النفط 63X 1.4NA مع الثقب من 1-1،1 حدات إيري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبدء التصوير، واستخدام الحقل مشرق للعثور على منطقة تمثيلية على الشريحة الغرفة. بعد ذلك، حدد الحقل عن طريق النقر على خيار الوظيفة على البرنامج. للكشف عن GFP في المسار 1 استخدام مجموعة تصفية 488 نانومتر ليزر مع الخائن شعاع في 582 نانومتر، للكشف عن الموجات بين 488 و 582 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في المسار 2 اختيار مرشح وضع الأمثل لmCherry (RFP) باستخدام الحزمة الخائن في 578 نانومتر، والكشف عن موجات بين 578 و 600 نانومتر. استخدام 488 نانومتر و 578 نانومتر ليزر مع قوة الليزر 50٪ وانتاج كسب 600-700. الحصول على الصور كل 30 ثانية ليصبح المجموع 90 دقيقة. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Janeway, C. A. Jr, Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate immune recognition.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 197-216 (2002).</li>
<li>Underhill, D. M., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+processing+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Information processing during phagocytosis.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 492-502 (2012).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annu Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).</li>
<li>Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+macrophage+%26%2334%3Bprobing%26%2334%3B+is+required+for+the+efficient+capture+of+phagocytic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic macrophage &#34;probing&#34; is required for the efficient capture of phagocytic targets.</a> J. Cell Biol. 191, 1205-1218 (2010).</li>
<li>Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+cups+into+phagosomes+and+macropinosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shaping cups into phagosomes and macropinosomes.</a> Nat. Rev. Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).</li>
<li>Botelho, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+biphasic+changes+in+phosphatidylinositol-4%2C5-bisphosphate+at+sites+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized biphasic changes in phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate at sites of phagocytosis.</a> J. Cell Biol. 151, 1353-1368 (2000).</li>
<li>Tafesse, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Sphingolipid+Biosynthesis+Blocks+Phagocytosis+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Disruption of Sphingolipid Biosynthesis Blocks Phagocytosis of Candida albicans.</a> PLoS Pathog. 11, e1005188(2015).</li>
<li>Kwik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+cholesterol%2C+lateral+mobility%2C+and+the+phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphate-dependent+organization+of+cell+actin%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Membrane cholesterol, lateral mobility, and the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-dependent organization of cell actin.</a> PNAS. 100, 13964-13969 (2003).</li>
<li>Levin, R., Grinstein, S., Schlam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositides+in+phagocytosis+and+macropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22BBA%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositides in phagocytosis and macropinocytosis.</a> BBA. 1851, 805-823 (2015).</li>
<li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+receptors%2C+signal+integration%2C+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol. Rev. 262, 193-215 (2014).</li>
<li>Jutras, I., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Annu. Rev. Cell. 21, 511-527 (2005).</li>
<li>Strijbis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruton%27s+Tyrosine+Kinase+%28BTK%29+and+Vav1+contribute+to+Dectin1-dependent+phagocytosis+of+Candida+albicans+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Bruton's Tyrosine Kinase (BTK) and Vav1 contribute to Dectin1-dependent phagocytosis of Candida albicans in macrophages.</a> PLoS Pathog. 9, e1003446(2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta-glucan+receptor+Dectin-1+activates+the+integrin+Mac-1+in+neutrophils+via+Vav+protein+signaling+to+promote+Candida+albicans+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The beta-glucan receptor Dectin-1 activates the integrin Mac-1 in neutrophils via Vav protein signaling to promote Candida albicans clearance.</a> Cell Host Microbe. 10, 603-615 (2011).</li>
<li>Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+recognition+is+mediated+by+the+association+of+dectin-1+and+galectin-3+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Fungal recognition is mediated by the association of dectin-1 and galectin-3 in macrophages.</a> PNAS. 108, 14270-14275 (2011).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Meth. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24974023">Fluorescence live cell imaging.</a> Meth. Cell Biol. 123, 77-94 (2014).</li>
<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li>
<li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+that+Coordinates+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier that Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li>
<li>Jaumouille, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+reorganization+by+Syk+regulates+Fcgamma+receptor+responsiveness+by+increasing+its+lateral+mobility+and+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton reorganization by Syk regulates Fcgamma receptor responsiveness by increasing its lateral mobility and clustering.</a> Dev. Cell. 29, 534-546 (2014).</li>
<li>Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+into+host-fungal+pathogen+interactions+derived+from+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Immunopath%22%5BJournal%5D)">Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging.</a> Sem. Immunopath. 37, 131-139 (2015).</li>
<li>Forestier, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+host-Leishmania+interactions%3A+significance+in+visceral+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Para.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging host-Leishmania interactions: significance in visceral leishmaniasis.</a> Para. Immunol. 35, 256-266 (2013).</li>
<li>John, B., Weninger, W., Hunter, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+imaging+the+innate+and+adaptive+immune+response+to+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Advances in imaging the innate and adaptive immune response to Toxoplasma gondii.</a> Future Microbiol. 5, 1321-1328 (2010).</li>
</ol>

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

البالعات المهنية، مثل الضامة والخلايا الجذعية، تبتلع، والقضاء على غزو الجراثيم مما يجعل البلعمة عنصرا هاما من نظام دفاع المضيف. وخلال هذه العملية البالعات تخضع إعادة تنظيم الغشاء واسعة النطاق وإعادة ترتيب الهيكل الخلوي في سطحها خلية 8، 19، 20. من أجل فهم أفضل هذه العملية الحيوية، وتصور مختلف مراحل البلعمة أمر ضروري. نحن هنا وصف طريقة القائم المجهر الذي تم استخدامه لمراقبة مختلف مراحل البل...

وعلى الرغم من التعرض المستمر لمسببات الأمراض مثل البكتيريا والفيروسات والفطريات، وأجسامنا مجهزة تجهيزا جيدا مع الآلية المناعية التي توفر الحماية ضد العدوى. نظام المناعة الفطري هو خط الدفاع الأول ضد الجراثيم الغازية ويعتمد أساسا على الخلايا البلعمية التي تعترف واستيعاب اهداف اجنبية. البلعمة هي عملية الخلوية الحفاظ تطويريا الذي يشمل ابتلاع الجسيمات غير المرغوب فيها أكبر من 0.5 ميكرون. الخلايا البلعمية تعبر عن مجموعة واسعة من مستقبلات المناعة (المعروف أيضا باسم مستقبلات التعرف على الأنماط، PRRs) على سطح الخلية التي تمكنهم من التعرف على الأنماط الجزيئية المرتبطة الممرض (PAMPs) موجودة على مسببات الأمراض قبل الغمر 3. الممرض ويتبع ملزمة من قبل تجمع مستقبلات على سطح الخلية ويطلق تشكيل كوب البلعمة. وهذا يؤدي إلى يحركها الأكتين يعيد الغشاء الذي يبرز حولالهدف، في نهاية المطاف يغلف ذلك ومعسر النعاس، لتشكل منفصلة phagosomal فجوة 2، 5. ويبلوع ثم ينضج والخواص الحمضية الانصهار لاحق مع أواخر الإندوسومات والجسيمات الحالة التي تشكل يحلول يبلوعي 6. على الرغم من أن يوصف البلعمة كما بوساطة مستقبلات ويحركها الأكتين الحدث، وهذه العملية تعتمد أيضا على تعديل المكانية والزمانية من الدهون التي تشكل غشاء البلازما، مثل phosphoinositides (حزب القانون والعدالة)، والإسفنجية 7 و 8. في حين تمليه البلمرة أكتين من قبل تراكم المحلي phosphoinositol-4،5-biphosphate (PI (4،5) ف 2) في قاعدة الكأس أكلة، الأكتين التحلل يعتمد على تحويل (PI (4،5) ف 2 إلى كل من التعديلات phosphoinositol-3،4،5-biphosphate (PI (3،4،5) ف 3) 3 و 9.لا غنى عنها كما يؤدي السابقة للتمديد الناجح لpseudopods حول الهدف وهذا الأخير تمكن غرق الجزيئات في العصارة الخلوية للبلعمية 10. الخلايا التي لديها القدرة في phagocytose إما البالعات المهنية، مثل الضامة / حيدات، والمحببة / العدلات، والخلايا الجذعية (DCS) أو البالعات غير مهني، مثل الخلايا الليفية والخلايا الظهارية 11. البلعمة التي يقوم بها كل البالعات تلعب دورا مركزيا في صيانة الأنسجة وإعادة عرض، في حين البلعمة التي يقوم بها البالعات المهنية هي المسؤولة عن تنسيق الاستجابة المناعية الفطرية والتكيفية ضد مسببات الأمراض. البالعات المهنية لا فقط يغمر وقتل الممرض، ولكن أيضا المستضدات الموجودة على الخلايا اللمفاوية في الجهاز المناعي التكيفي. هذا يساهم في الإفراج عن السيتوكينات الموالية للالتهابات وإلى إشراك الخلايا اللمفاوية، وبالتالي يؤدي إلىالحصار الناجح لإصابة 12. وقد تقنيات الكيمياء الحيوية التقليدية دورا أساسيا في اكتساب المعرفة حول الآلية الجزيئية من العمليات الخلوية المختلفة خلال البلعمة، مثل التعديلات بعد متعدية ومختلف الجمعيات عالية تقارب بين البروتينات. ومع ذلك، فمن الصعب الحصول على معلومات بشأن ديناميات المكانية والزمانية لأحداث أكلة باستخدام الطرق الكيميائية الحيوية التقليدية. الخلية الحية التصوير ليس فقط يسمح لنا لرصد الأحداث الخلوية بطريقة حساسة الوقت ولكن أيضا تمكننا من الحصول على معلومات على مستوى خلية واحدة. نحن هنا تصف طريقة للتحقيق في مراحل مختلفة من البلعمة، وكذلك لتحليل العملية برمتها spatiotemporally باستخدام متحد البؤر المجهري.

<table><tbody><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>AppliChem</td><td>A1108</td><td></td></tr><tr><td>ألبومين مصل الأبقار (BSA)</td><td>تقنية إشارات الخلية&nbsp;</td><td>9998</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole ، Dilactate) ThermoFisher</td><td></td> <td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ThermoFisher</td><td></td> <td>BP-231-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco' s الحد الأدنى من النسر s متوسط)</td> <td>Gibco</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>PBS ، 1x (محلول ملحي مخزن بالفوسفات)</td> <td>Corning cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنيني</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>حبات اللاتكس المطلية ب IgG المقترنة ب FITC</td><td>كايمان</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 ملم (100x)</td> <td>محلول ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (4٪ في PBS)</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td></td></tr><tr><td>البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)</td> <td>ThermoFisher</td> <td><a href = "https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-penicillin-streptomycin-10-000-u-ml-3/15140122" >15-140-122< / a></td><td></td></tr> <tr><td>Phalloidin-Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 خلايا</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (معهد روزويل بارك التذكاري)</td><td>Gibco</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>محلول تريبان الأزرق (0.4٪ (وزن / حجم) في PBS)</td><td>Corning cellgro</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (1x) (0.05٪)</td> <td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 محلول منظف Surfact-Amps</td><td>ThermoFisher</td> <td>&nbsp; 85114</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan-Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>Z23374</td><td></td></tr><tr><td>1.0 نظام غطاء زجاجي من البورسليكات (8 غرف)</td><td>ThermoFisher</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>شريحة زجاجية 10 مع شبكات</td><td>Hycor</td><td>87144</td><td></td></tr></tbody></table>

تصور المراحل المبكرة من البلعمة

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

وقد تم تجهيز جسم الثدييات مع طبقات مختلفة من الآليات التي تساعد على الدفاع عن نفسها من الغزوات الممرض. البالعات المهنية للنظام المناعي - مثل العدلات، والخلايا الجذعية، والضامة - تحتفظ القدرة الفطرية لكشف ومسح هذه الجراثيم الغازية من خلال البلعمة 1. تتضمن البلعمة الأحداث فشلت في إعادة تنظيم الغشاء وإعادة الأكتين على سطح الخلية 2 و 3. البالعات استيعاب بنجاح والقضاء على الجزيئات الغريبة فقط عندما يتم استيفاء جميع مراحل البلعمة. وتشمل هذه الخطوات الاعتراف وملزمة من مسببات المرض عن طريق مستقبلات التعرف على الأنماط (PRRs) المقيمين على سطح الخلية، وتشكيل كوب أكلة من خلال نتوءات غشائي التخصيب الأكتين (pseudopods) لتطويق الجسيمات، وانفصال من يبلوع تليها النضج يحلول يبلوعي أن النتائج فيمقتل الممرض 3 و 4. التصوير النوعي والكمي لمراحل مختلفة من البلعمة هو أساسي لتوضيح الآليات الجزيئية لهذه العملية الخلوية. المخطوطة تقديم تقارير طرق لدراسة مختلف مراحل البلعمة. نحن تصف النهج القائم على المجهر لتصور وتحديد، تشكيل كوب أكلة ملزم، واستيعاب الجسيمات من قبل البالعات. كما تحدث البلعمة عندما مستقبلات الفطرية على الخلايا البلعمية تواجه بروابط على الجسيمات الهدف أكبر من 0.5 ميكرون، والمقايسات نقدم هنا تشمل استخدام الفطريات المسببة للأمراض المبيضات البيض وغيرها من الجسيمات مثل زيموزان وحبات مغلفة مفتش.

وتقدم طريقة القائم على المجهر لمراقبة مختلف مراحل البلعمة. وأظهرت أحداث مختلفة خلال البلعمة من مختلف الجسيمات الفلورسنت من الخلايا DC2.4. استخدام الأساليب المذكورة هنا، ونحن التحقيق في دور الإسفنجية في المراحل المبكرة من البلعمة. لهذا الغرض، DC2.4 الخلايا الجذعية ناقصة وراثيا في Sptlc2، الإنزيم الذي يحفز الخطوة الأولى والحد من معدل في مسار السكروز الشحميات السفينغولية، استخدمت. بالمقارنة مع خلايا نوع البرية، Sptlc2 - / - خلايا DC2.4 خفضت بشكل كبير مستوى الإسفنجية بما في...

نصف هنا تقنية قائمة على المجهر لتصور وتحديد الشلالات المبكرة للأحداث أثناء البلعمة لمسببات الأمراض مثل الفطريات المبيضات البيضاء والجسيمات التي يزيد حجمها عن 0.5 ميكرومتر بما في ذلك الخرز الزيموزان والمغلفة ب IgG.

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

الهدف الزائد لهذه التقنية هو مراقبة المراحل المختلفة للبلعمة باستخدام مجهر متحد البؤر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تفاعلات مسببات الأمراض المتقاطعة. بشكل أساسي لفهم كيفية دخول مسببات الأمراض إلى الخلايا المضيفة أثناء الإصابة.الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بسيطة وتمكننا من الحصول على معلومات حول الخلية الفيروسية لأحداثنا التي تحدث أثناء البلعمة بطريقة حساسة للوقت. للبدء ، قم بإعداد zymosan المترافق بالفلورسنت كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. في اليوم السابق ، قم بزرع حوالي خمسة أضعاف 10 إلى خلايا DC 2.4 الرابعة في شريحة غرفة ، بحيث تكون الآبار 60 إلى 70٪ ملتقية في وقت التجربة.بمجرد أن تصبح الخلايا بكثافة مناسبة ، ضع شريحة الغرفة على حرارة 10 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. يعد تبريد الخلايا ضروريا لمنع الالتقام الخلوي وكذلك وقت تبديل الالتقام الخلوي. وبعد ذلك للحصول على البلعمة المتزامنة.بعد ذلك ، قم بإزالة الوسط برفق من كل بئر باستخدام ماصة أو شفاطة. بعد ذلك ، امزج الزيموزان المترافق بالفلورسنت مع وسط زراعة الخلايا بمعدل تعدد من العدوى 10. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من الوسط إلى كل غرفة جيدا للتأكد من تغطية كل الخلية.ثم قم بتدوير شريحة الغرفة لزيادة التلامس بين الجسيمات في الخلايا ومزامنة عملية الترابط. بعد الطرد المركزي ، انقل شريحة الغرفة إلى حاضنة رطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. بعد خمس دقائق عند 37 درجة مئوية ، قم بإزالة شريحة الغرفة من الحاضنة وشفط الوسط.ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني مثلج بارد. بعد الغسيل النهائي ، تحقق من وجود جزيئات غير مرتبطة بمجهر ضوئي وقم بإجراء غسلات إضافية إذا لزم الأمر. من الضروري إزالة الجسيمات غير المنضمة من الآبار لتقليل ضوضاء الخلفية أثناء التحليل.بعد ذلك ، قم بإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من أربعة بالمائة بارافورمالدهيد في PBS إلى الآبار ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد تثبيت الخلايا ، اغسلها بإضافة 500 ميكرولتر من PBS إلى كل غرفة ثم شفط المحلول برفق. كرر خطوة الغسيل مرتين أخريين.بعد الجولة الثالثة من الغسيل ، أوقف التفاعل عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من 50 مللي مولار كلوريد الأمونيوم في PBS إلى الخلايا واحتضانها لمدة 10 دقائق. ثم اغسل الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS بدرجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم باختراق الخلايا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المرتبط لكل بئر واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.الخطوة التالية هي تلطيخ F-actin عن طريق إضافة الفالودين المترافق بالفلورسنت إلى الخلايا واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من PBS. أخيرا ، التقط الصور باستخدام مجهر متحد البؤر وقم بتحليل الصور باستخدام ImageJ.من أجل قياس امتصاص الزيموزان ، قم بإعداد شرائح الغرفة بالخلايا كما هو موضح في مقايسة الربط. باتباع خطوات التبريد ووضع العلامات ، انقل شريحة الغرفة إلى حاضنة رطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. واحتضان الخلايا لنقاط زمنية مختلفة.قم بإصلاح الخلايا بعد 30 و 60 و 90 دقيقة من الإصابة. تأكد من تحسين هذه النقاط الزمنية بناء على نوع الخلية المعنية وجزيئات الفلورسنت المستخدمة. ثم قم بتحليل الصور باستخدام ImageJ.يتميز الامتصاص الناجح باستيعاب كامل للجسيمات داخل سيتوبلازم الخلية البلعمة. للبدء ، قم بإعداد غرفة بيئية لمرحلة المجهر عن طريق تسخينها إلى 37 درجة مئوية وموازنة الغرفة ب 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. انتظر من 30 إلى 45 دقيقة حتى تستقر درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون قبل التصوير.رؤية ثاني أكسيد الكربون2 ومستويات درجة الحرارة أمر بالغ الأهمية للبلعمة ، كما هو مهم لتشغيل سخان المجهر قبل التجربة لتحقيق التوازن في بيئة تلك الغرفة. بعد ذلك ، قم بإعداد شرائح الغرفة بخلايا DC 2.4 التي تثبت التعبير عن mCherry F-actin كما هو موضح في مقايسة الربط. باتباع خطوات التهدئة ووضع العلامات ، انقل شريحة الغرفة من جهاز الطرد المركزي مباشرة إلى مرحلة المجهر الدافئ مسبقا.أخيرا ، قم بإجراء تصوير مباشر باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب ، ليس فقط لالتقاط حركة وديناميكيات شبكة F-actin ، ولكن أيضا لتصور الأحداث البلعمية المختلفة داخل الخلايا الحية. الخلايا الموضحة هنا باللون الأخضر هي خلية من النوع البري DC 2.4 مصابة ب BFP الكندي الذي يظهر باللون الأحمر. يستخدم التصوير بفاصل زمني لتصور المراحل المبكرة من البلعمة ويظهر هنا على فترات 30 ثانية.المواقع المشار إليها بعلامة النجمة هي المكان الذي تحدث فيه إعادة تشكيل الأكتين. تحدث العملية برمتها في غضون بضع دقائق. هنا تم تقييم دور السفينجوليبيدات لدورها في المراحل المبكرة من البلعمة.باستخدام هذه التقنية ، وجد أن الشحوم السفينغولية ضرورية لارتباط المبيضات البيضاء بالخلايا وتقليل البلعمة العامة. تم عرض هذا الانخفاض في الارتباط البلعمي أيضا لارتباط خلية DC 2.4 بالزيموزان. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء التصوير المباشر لدراسة المرحلة المبكرة من البلعمة.بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعة إلى ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء البلعمة لمسببات الأمراض الأخرى ، بما في ذلك البكتيريا والطفيليات ، من أجل فهم العلاقة المعقدة بين الخلايا المناعية ومسببات الأمراض. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلية ، لاستكشاف الالتقام الخلوي بوساطة المستقبلات بما في ذلك البلعمة وكثرة الخلايا الكبيرة في الخلايا المناعية.

visualizing-the-early-stages-of-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يوضح هذا الفيديو فحصا لمراقبة أحداث البلعمة المستقلة لخلايا الدم الحمراء (RBC) بوساطة البلاعم. يتم تحضين كرات الدم الحمراء البشرية ذات الغلوبولين المناعي للفأر G (IgG) مع البلاعم الفأرية ويتم ملاحظتها تحت المجهر متحد البؤر. تبتلع كرات الدم الحمراء بواسطة الضامة عن طريق تكوين كوب البلعمة وتستهدف التحلل الليزوزومي.

التصوير في الوقت الحقيقي لكثرة البلعمة الضامة لخلايا الدم الحمراء IgG

يوضح هذا الفيديو تقنية الفحص المجهري الفلوري الكلي للانعكاس الداخلي (TIRF) عالية الدقة للتصور في الوقت الفعلي لتكوين البلعمة وإغلاقه أثناء البلعمة بوساطة البلاعم لخلايا الدم الحمراء (RBCs) ذات القابلية IgG المرتبطة بسطح طبق زجاجي القاع. تمتد البلاعم الكاذبة حول كرات الدم الحمراء وتبتلعها داخل البلعمة ، وتفصلها عن السطح الزجاجي.

التصور القائم على الفحص المجهري TIRF لتشكيل البلعمة وإغلاقها

وصفنا طرق للفحص المجهري لقطات فيديو حية من...

الخلية الحية المجهرية فيديو البلعمة الممرض الفطرية

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

دراسة يحلول يبلوعي النشوء الأحيائي في الضامة لايف

نقدم هنا بروتوكولا لتحديد البلعمة لجزيئات الفلورسنت عن طريق خط خلية البلاعم الملتصقة باستخدام طريقة الفلورومترية. تسهل هذه الطريقة القياس الكمي عالي الإنتاجية لاستيعاب الجسيمات بالإضافة إلى بلمرة الأكتين الناتجة.

تقنية عالية الإنتاجية فلوروميتريك تقييم بلعم البلعمة وأكتين البلمرة

نصف إعدادا تجريبيا لتصور تكوين البلعمة عالية الدقة غير المسبوقة وإغلاقه في ثلاثة أبعاد في البلاعم الحية ، باستخدام الفحص المجهري الفلوري الانعكاس الداخلي الكلي. يسمح بمراقبة قاعدة الكأس البلعمية ، والأرجل الكاذبة الممتدة ، بالإضافة إلى الموقع الدقيق لقص البلعمة.

&quot;يبلوع إغلاق الفحص&quot; لتصور يبلوع تشكيل في ثلاثة أبعاد عن طريق التأمل إجمالي الداخلية نيون الميكروسكوب (TIRFM)

توضح هذه المخطوطة طريقة بسيطة لقياس درجة الحموضة phagosomal والمنطقة وكذلك درجة الحموضة هيولي العدلات الإنسان والفأر باستخدام مؤشر ratiometric seminaphthorhodafluor (SNARF) -1، أو S-1. ويتحقق ذلك باستخدام خلايا الحية متحد البؤر المجهري مضان وتحليل الصور.

تصوير العدلات يبلوع والسيتوبلازم باستخدام الرقم الهيدروجيني المؤشر Ratiometric

هنا يمكننا وصف أساليب استخدام الغزل القرص المجهري [كنفوكل] إلى أحداث متجولة واحد الصورة بالماوس الضامة البريتوني المقيم. ويمكن تمديد البروتوكولات إلى خلايا أخرى متجولة.

الوقت الفاصل بين التصوير 3D البلعمه التي الضامة الماوس

الآلية المرتبطة البلعمة في عدوى الليشمانيا لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. هنا ، نصف طرق لتقييم الأحداث المبكرة التي تحدث أثناء تفاعل الليشمانيا مع الخلايا المضيفة.

التحقيق في البلعمة من الليشمانيا باستخدام المجهر البؤري

يقدم هنا بروتوكول لتحديد وإنتاج صور ديناميكية للخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) لتنظيم البلعمة الضامة (MΦ) من جزيئات الخميرة غير opsonized (zymosan) التي يتم اقترانها بجزيء فلوري حساس ل درجة الحموضة.

تنظيم الخلايا الجذعية Mesenchymal من البلعم البلعمي; الكمية والتصوير

توضح هذه الدراسة المعالجة البلعمية لجزيئات جودانتي باسما (GB) في خلايا الثدييات ، وتميز امتصاصها الخلوي ، وديناميكيات الفجوة ، والتحمض ، والتدهور. لا تعزز هذه النتائج فهمنا لآليات البلعمة الأساسية فحسب ، بل تؤسس أيضا GB كنظام نموذجي واعد لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة.

استكشاف الأحداث الخلوية المتسلسلة للبلعمة الناجمة عن Godanti Bhasma في خلايا الثدييات

تعلم تصور مراحل البلعمة المبكرة باستخدام المجهر المكافئ الضوئي لمراقبة تفاعلات المضيف مع المسببات المرضية مثل Candida albicans. هذه الطريقة البسيطة تتيح تحليلاً حساساً للوقت.

تصور المراحل المبكرة من البلعمة

استكشف المزيد من الفيديوهات