إعداد ألياف البروتين خارج الخلية مصفوفة لBrillouin الطيفي

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد عينة من ألياف البروتين خارج الخلية أو الكولاجين أو الإيلاستين ليتم تركيبها في حجرة العينة لقياسات التحليل الطيفي بريلوين. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن الحصول على ألياف الكولاجين والإيلاستين للمصفوفة خارج الخلية من الأنسجة الضامة من أصل حيواني لاستخدامها في قياسات التحليل الطيفي بريلوين. الميزة الرئيسية لهذا النهج هي أنه يمكن تحديد الخصائص الميكانيكية الدقيقة للعينة بالكامل دون معرفة مسبقة بمعامل الانكسار للمادة.

بينما لا يزال الذيل مجمدا ، قم بقطع جزء طوله 20 ملم من الطرف القريب وقم بإذابة الأنسجة في طبق بتري مليء بدرجة حرارة الغرفة PBS. عندما يتم إذابة الذيل ، استخدم مشرطا لعمل شق على طول العينة لتقسيم الجلد ، وتقشير الأنسجة للخلف للكشف عن أربع حزم من وتر الغمد حول فقرات الذيل. باستخدام ملقط ناعم ، اسحب كل ألياف برفق من الغلاف وضعها في قارورة تحتوي على ماء مقطر مكمل بنسبة 0.01٪ وزن لكل حجم أزيد الصوديوم للتخزين عند أربع درجات مئوية.

للحصول على الكولاجين الليفي النقي من النوع الأول ، اغمر الألياف في شوندروتن ، ABC في عازلة تريس وخلات الصوديوم لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزازية. في اليوم التالي ، انقل الألياف إلى streptomyces hyaluronidase في عازلة tris وكلوريد الصوديوم لمدة 24 ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية في حاضنة الاهتزاز. ثم اغمر الألياف في التربسين في فوسفات الصوديوم وكلوريد الصوديوم لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الرج.

يمكن بعد ذلك تخزين الألياف النقية عند أربع درجات مئوية في قوارير من الماء المقطر مكملة بنسبة 0.01٪ أزيد الصوديوم لحين الحاجة. لاستخراج ألياف الإيلاستين في الرباط القفوي البقري أولا إزالة الدهون من الرباط القفوي البقري الذي تم الحصول عليه حديثا. عندما تتم إزالة كل الدهون ، أضف الرباط إلى قارورة مخروطية وقم بتغطية الأنسجة بهيدروكسيد الصوديوم المحضر حديثا في الماء المقطر.

اغلي الرباط في حمام مائي 95 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. ثم اغسل الكتلة غير القابلة للذوبان بشكل متكرر في دورق مملوء بالماء المقطر. عند الحصول على درجة حموضة 7.0 ، اغمر الأنسجة في الماء المقطر المكمل بنسبة 0.01٪ أزيد الصوديوم وأغلق الحاوية للتخزين عند أربع درجات مئوية لحين الحاجة.

بعد التخزين ، استخدم الملقط لسحب أجزاء الإيلاستين الأصغر بسمك ملليمترين تقريبا وطولها من 20 إلى 50 ملم برفق من الكتلة الأكبر. ضع الأجزاء في طبق بتري يحتوي على PBS واستخدم ملقطا دقيقا لإثارة حزم الألياف بسمك ملليمتر واحد تقريبا من الشرائح. ثم استخدم مشرطا لتقطيع الحزم إلى أجزاء بطول بضعة ملليمترات ونقل قطع الألياف إلى قوارير من الماء المقطر مكمل بنسبة 0.01٪ أزيد الصوديوم للتخزين عند أربع درجات مئوية لحين الحاجة.

لتركيب الألياف على ركيزة عاكسة ، استخدم أولا قاطع الماس لتقسيم قطعة من شريحة السيليكون العاكسة. بعد ذلك ، قم بقص شريط من الفيلم الجزئي مع تجويف في المنتصف كبير بما يكفي لحمل قطعة من الألياف ووضع الفيلم الجزئي على ركيزة السيليكون. استخدم الآن زوجا من الملقط الدقيق لنقل ألياف واحدة من محلول التخزين بأربع درجات مئوية إلى طبق بتري صغير مملوء بالماء النقي بدرجة حرارة الغرفة.

بعد 5 دقائق ، انقل الألياف المغسولة إلى وسط المجوف شبه الفيلم على ركيزة السيليكون. ثم ضع غطاء زجاجيا رقيقا فوق الألياف وضع مكواة لحام ساخنة برفق فوق الزجاج لإذابة الفيلم الصغير أسفل الزجاج. لتمكين الدوران المستوي للعينة مع الحفاظ على زاوية تشتت ثابتة وموضع الحجم ، قم بتركيب العينة على حامل رأسي مزود بمقياس الزوايا ووضعه عند 45 درجة على شعاع الليزر الساقط.

في ألياف الكولاجين الجافة بزاوية دوران محددة تبلغ صفر درجة ، تؤدي الأوضاع الطولية إلى ذروة سائبة عند 18.92 جيجا هرتز ، بينما تعطي الأوضاع الموازية للسطح ذروة عند 9.85 جيجا هرتز. تتحول الذروة الموازية للسطح إلى ترددات منخفضة عند زاوية الدوران المحددة تقترب من 90 درجة ، في حين أن الذروة السائبة تتحول باللون الأحمر قليلا عند تغيير زاوية الدوران المحددة في نفس النطاق. في ألياف الكولاجين الرطبة ، تظل القمتان دون تغيير بشكل أساسي طوال التجربة ، حيث تبلغ الذروة السائبة 10.5 جيجا هرتز والذروة الموازية للسطح عند 4.9 جيجا هرتز ، مما يشير إلى انخفاض بنسبة 80 إلى 100٪ في التردد وحساب انخفاض صلابة المادة المائية.

في هذا الشكل ، يتم عرض مخطط لسرعة الموجة الصوتية للكولاجين الجاف الذي تم الحصول عليه من قمم موازية للسطح وعرضية كدالة لزاوية الدوران المحددة. في ألياف الإيلاستين الجافة المقاسة بزاوية دوران محددة تبلغ صفر درجة ، تحدث الذروة السائبة عند 16.8 جيجا هرتز ويحدث الوضع الموازي للسطح عند 8.2 جيجا هرتز. ومع ذلك ، فإن ألياف الإيلاستين الرطبة تقدم ذروة سائبة بتردد أقل بنسبة 37٪ من الذروة السائبة للإيلاستين الجاف مما يشير إلى انخفاض في صلابة الألياف.

كما هو الحال في الكولاجين الجاف ، هناك دليل على تباين الخواص في الخواص الميكانيكية لألياف الإيلاستين الجافة مما يدل على فعالية التحليل الطيفي Brillouin في الحصول على البيانات ذات الصلة حول الصلابة والتكوين والجوانب الهيكلية لمواد معينة ذات أهمية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير عينات من ألياف الكولاجين والإيلاستين للاختبار الميكانيكي الدقيق بناء على التحليل الطيفي لتشتت ضوء Brillouin.