الناجم المحفزة الجيل الخلايا الجذعية من خلايا الدم عن طريق سينداي الفيروسات والطرد المركزي

الهدف العام لهذه الدراسة هو إعادة برمجة خلايا الدم المحيطية أحادية النواة إلى خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات ، باستخدام الطلاء التسلسلي عن طريق الطرد المركزي. في الأصل, iPSCs, تم إنشاؤها عن طريق إعادة برمجة الخلايا الليفية. اليوم ، يتم استخدام العديد من إعادة البرمجة.

ومع ذلك, بسبب إمكانية الوصول إلى الدم, يمكن أن تكون PBMCs مصدرا للخلايا غير مقبولة لمزيد من تطبيق iPSCs, في فحص المخدرات, نمذجة أطروحة, وتطوير الطب التجديدي. من خلال الدراسة, سوف نشارك بروتوكولا حول إعادة برمجة iPSCs باستخدام PBMCs عن طريق إضافة قوة الطرد المركزي. سيوفر هذا البروتوكول خيارا آخر عند إعادة برمجة الخلايا العائمة.

لتوضيح الإجراء ، سنستخدم نام ، طالب دراسات عليا من مختبري. لعزل الخلايا أحادية الخلية ، احصل أولا على ما لا يقل عن عشرة ملليلتر من الدم الطازج من سحب الدم في أنبوب تحضير الخلية. بعد ذلك ، انقل الدم إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مليلتر وقم بتخفيفه باستخدام PBS معقم بنسبة واحد إلى أربعة.

بعد ذلك ، أضف عشرة ملليلتر من وسائط تدرج الكثافة إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مليلتر ، وقم بوضع طبقة من الدم المخفف بعناية فوق وسط تدرج الكثافة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 750 مرة جم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، دون انقطاع الطرد المركزي. بعد 30 دقيقة ، انقل الطبقة المصفرية بعناية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل.

أضف 30 مل من PBS ، واغسل الخلايا. ثم قم بالطرد المركزي للخلايا عند 515 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، تخلص من PBS ، وأعد تعليق الخلايا في 0.5 مل من وسائط خلايا الدم.

بعد ذلك ، عد الخلايا ووضعها في طبق مكون من 24 بئرا. أضف PBS إلى الآبار المحيطة لمنع التبخر. بعد ذلك ، قم بتثبيت الخلايا لمدة خمسة أيام عند 37 درجة مئوية قبل التنبيغ.

أضف 0.5 مل من وسائط خلايا الدم الطازجة في اليوم الثالث إلى الرابع ، دون إزعاج الخلايا. في هذا الإجراء ، انقل خلايا الدم إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر ، وعدها باستخدام مقياس الدم. بعد ذلك ، قم بإعداد ثلاث مرات من عشرة إلى الخلايا الخامسة للنقل ، وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 515 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية عن طريق الشفط ، وأعد تعليق الخلايا في 0.5 مل من وسائط خلايا الدم. ثم انقل الخلايا إلى بئر من صفيحة 24 بئرا غير مطلية. قم بإذابة خليط فيروس سينداي في الثلج وأضفه إلى الخلايا العالقة.

أغلق اللوحة بغشاء مانع للتسرب ، وقم بطردها عند 1 ، 150 مرة جم لمدة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها. لتغطية صفيحة 24 بئرا بفيترونكتين ، في اليوم التالي ، قم بتخفيف محلول الفيترونكتين في PBS للحصول على تركيز نهائي قدره خمسة ميكروغرام لكل مليلتر.

بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من الفيترونكتين إلى البئر ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول الطلاء ، وانقل جميع الوسائط التي تحتوي على الخلايا والفيروس إلى البئر المطلي. بعد ذلك ، اجمع الخلايا المتبقية مع 0.5 مل إضافية من وسائط خلايا الدم الطازجة وأضفها إلى البئر المحتوي على الخلية.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للوحة عند 1 ، 150 مرة جم لمدة عشر دقائق عند 35 درجة مئوية ، ثم حافظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها. لنقل الخلية الثانية ، قم بتغطية البئر بخمسة ميكروغرامات لكل مليلتر فيترونكتين كما هو موضح سابقا. استخدم بئر واحد من اللوحة لكل عملية نقل ، وانقل تعليق الخلية من اللوحة الأولى ، إلى لوحة vitronectin المطلية حديثا.

وفي الوقت نفسه, إضافة مليلتر واحد من وسائط iPSC إلى بئر من اللوحة الأولى للصيانة, واحتضانة في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون, مع تغيير الوسائط اليومية مع وسائط iPSC جديدة. ستظهر المستعمرات في اليوم من 14 إلى 21 ، بعد التنبيغ. جهاز الطرد المركزي اللوحة المطلية حديثا ، التي تحتوي على الخلايا العالقة ، عند 1 ، 150 مرة جم في 35 درجة مئوية لمدة عشر دقائق.

بعد الطرد المركزي ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بإزالة المادة الطافية ، واستبدلها بوسائط الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. حافظ على الخلايا المرفقة مع تغيير الوسائط اليومي ، حتى يتم الوصول إلى التقاء 80٪.

قبل أسبوع من قطف المستعمرة ، قم بالبذور مرة واحدة في عشرة إلى الخلايا الرابعة في طبق 100 ملم مغطى بفيتامين بعد ذلك ، قم بإعداد طبق 60 ملم مغطى بفيتامين ، عن طريق إضافة ملليلترين من محلول الفيترونكتين ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل. من خلال المراقبة من خلال المجهر ، ضع علامة على المستعمرات الموجودة في الجزء السفلي من اللوحة بحدود واضحة باستخدام قلم تحديد.

قم بإزالة محلول الفيترونكتين من اللوحة الجديدة ، وأضف ستة ملليلتر من وسائط الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ، مع عشرة مللي مولار RHO kinase. بعد ذلك ، قم بإزالة وسط الثقافة من الخلايا ، واغسلها بثلاثة ملليلتر من PBS. ثم, إضافة مليلتر واحد من محلول فصل مستعمرة iPSC, واحتضانها 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بإزالة المحلول من اللوحة ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية إضافية. بعد 30 دقيقة ، اسحب 200 ميكرولتر من الوسائط من اللوحة ، وافصل المستعمرات المستهدفة عن طريق سحب العينات. ثم انقل المستعمرات المتناثرة إلى طبق جديد بحجم 60 ملم.

احتضان الخلايا والحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تصل إلى المرور العاشر. في المرحلة المبكرة من إعادة البرمجة, تم خلط iPSCs مع الخلايا المتمايزة غير المبرمجة المرفقة. قبل التوسع, كانت iPSCs والخلايا الأخرى مختلفة للتمييز.

من خلال زرع الخلايا بكثافة منخفضة ، تم الحصول على مستعمرات كبيرة بما يكفي للقطف. بعد عزل المستعمرة ، تم تفكيك كتل الخلايا إلى خلايا مفردة ، وزراعتها. شوهدت مستعمرات iPSC النقية بعد ذلك.

بعد توسيع الخلايا الجذعية المستحثة النقية متعددة القدرات ، تم اختبار جودة الخلايا. تم تلطيخ الخلايا بالفوسفاتيز القلوي لتأكيد الحالة غير المتمايزة للخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. أظهرت المستعمرات المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة المعزولة تلطيخا إيجابيا.

تم تأكيد العلامات متعددة القدرات عن طريق تلطيخ الفلورسنت المناعي. الخلايا المعاد برمجتها علامات متعددة القدرات عالية التعبير عنها ، مثل SSEA4 و Oct4 و Sox2 و TRA-1-81 و Klf4 ، والأهم من ذلك ، TRA-1-60 ، تم تأكيد التعبير عن العلامات متعددة القدرات بواسطة RTPCR. باستخدام الطلاء التسلسلي عن طريق الطرد المركزي ، يستخدم مرفق العبور PBMC على لوحة مطلية بالمقاييس.

المرفقات هناك كما معلقة, ومستعمرات iPSC هي تكرار لتنقية. باستخدام هذا البروتوكول, يمكن إنشاء iPSC من PBMCs في غضون شهر. يقلل هذا البروتوكول من الوقت اللازم لربط الخلايا المنقولة ويمنع فقدان الخلايا المعاد برمجتها التي لم تكن قادرة على الالتصاق من تلقاء نفسها.

ومع ذلك, يمكن أن يكون تنقية iPSCs المعاد برمجتها بالكامل لتشكيل المستعمرات أمرا بالغ الأهمية, عند محاولة هذا الإجراء. في السابق ، نجحنا في إعادة برمجة PBMCs والخلايا أحادية النواة باستخدام هذا البروتوكول. يمكن استخدام iPCs المشتقة من خلايا الدم المتولدة على نطاق واسع في مختلف مجالات البحث.

يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في عملية إعادة برمجة الأنواع الأخرى من خلايا التعليق العائمة ، لمزيد من التطبيقات والدراسات.