المتقدم نموذج حيواني من القولون والمستقيم ورم خبيث في الكبد: تقنيات التصوير وخصائص النقيلي النسخ

يتمثل الهدف العام من هذا النهج في نمذجة استعمار الكبد بواسطة النسائل الورمية النقيلية الناتجة عن سرطانات القولون والمستقيم، واستخدام هذا النموذج لتحسين تشخيص وعلاج نقائل الكبد. وتشير الملاحظات السريرية إلى تباين المرض النقيلي. ويوفر نموذجنا القدرة على رصد هذا التباين للكشف عن الجينات المرتبطة بأمراض النقائل القليلة (oligometastatic) والنقائل المتعددة (polymetastatic).

ولاستخدام هذه المعرفة في تحسين الكشف المبكر عن النقائل وعلاجها. تكمن الميزة الرئيسية لتقنيتنا في استخدام خطوط خلوية أحادية النسيلة مزدوجة الوسم مشتقة من مرضى سرطان القولون والمستقيم، مما يتيح مراقبة تطور النقائل الكبدية داخل الجسم (in vivo) وخارجه (ex vivo). وتمتد تطبيقات هذه التقنية نحو علاج الأمراض النقيلية.

تمنحنا هذه الطريقة القدرة على اختبار أي دواء محتمل مع تقدير كمي لأعداد الآفات النقيلية وحركية نمو كل آفة. بعد توليد خلايا HCT116 الموصومة بـ luciferase tdTomato وتحضير الأوساط والكواشف والأجهزة وفقاً للبروتوكول المكتوب، يتم توزيع الخلايا المنقولة بالكثافات التالية لكل بئر، في ثلاث مكررات، في أطباق ذات 96 بئراً. وبعد تحضين الخلايا لمدة خمس ساعات، يتم قياس شدة فلورة tdTomato باستخدام نظام IVIS عن طريق تشغيل برنامج التصوير على سطح المكتب.

انقر فوق زر Initialize لتهيئة وقت التصوير، ودمج البيكسلات المتوسط (medium binning)، و 2 لفتحة العدسة (F/Stop)، و 535 لمرشح الإثارة، و 580 لمرشح الانبعاث. ضع الطبق ذو الـ 96 بئراً على محطة التصوير، ثم انقر فوق Acquire لبدء التصوير. بعد الحصول على الصورة، انقر فوق ROI tools في لوحة الأدوات (Tool Palette) واختر 12x8 من أيقونة الشق.

قم بإنشاء 12x8 شقاً لتغطية منطقة الإشارة الموجودة في صورة الصفيحة ذات الـ 96 بئراً، ثم انقر فوق علامة تبويب القياسات (Measurements). ستظهر نافذة تحتوي على جدول قياسات المنطقة ذات الاهتمام (ROI) بوحدات فوتون في الثانية، لكل ستراديان، لكل سنتيمتر مربع. وبمجرد وصول الخلايا إلى نسبة تلاحم تتراوح من 70 إلى 80%، وذلك قبل ساعة واحدة تقريباً من الحقن في الطحال، أضف 0.05% tripsin و 0.53 millimolar EDTA إلى الخلايا لفصلها.

بعد تحضين الخلايا لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق، استخدم حجماً مساوياً من C-DMEM لمعادلة التريبسين. قم بسحب المزارع باستخدام الماصة جيداً لتجنب التكتل، ثم استخدم عداد خلايا أوتوماتيكياً لعد الخلايا. قم بتجميد الخلايا العالقة في 1x DBPS بتركيز يتراوح من 1.2 إلى 2 x 10⁶ خلية لكل 100 microliters، مع السحب بالماصة جيداً لتجنب التكتل.

بعد ذلك، تُحفظ الخلايا على الثلج حتى وقت الحقن، مع إعادة تعليقها في الأنبوب من حين لآخر. وبعد إعطاء المسكنات وتخدير فأرة أنثى عارية عديمة التيموس (athymic nude mouse) يتراوح عمرها بين ستة وثمانية أسابيع وفقاً لبروتوكول النص، يتم تحديد الطحال كمنطقة أرجوانية تظهر خارجياً من خلال الجلد على الجانب الأيسر، ويُجرى شق بطول 8 mm في جلد الجانب الأيسر فوق العضو مباشرة. بعد ذلك، يُرفع جدار البطن ويُجرى شق صغير.

اسمح بدخول الهواء إلى التجويف البطني بحيث تبتعد الأعضاء الداخلية عن موقع الشق. بعد ذلك، قم بتوسيع شق جدار البطن إلى حوالي خمسة مليمترات. تُعد الخطوات الموضحة لعملية الحقن بالغة الأهمية لإتمام الإجراء.

يمكن أن يؤدي تسرب الخلايا الورمية أثناء الحقن إلى حدوث نقائل خارج الكبد. يجب إجراء الحقن ببطء، على مدار 30 إلى 60 ثانية، وبعدد خلايا لا يتجاوز 1.5 مليون خلية لمنع حدوث خثار الوريد البابي. قم بكشف الطحال باستخدام مسحة قطنية لتطبيق ضغط خفيف حول الشق الجراحي.

إذا لزم الأمر، يمكن تحريك الدهون البنكرياسية برفق للمساعدة في كشف الطحال، وذلك لتجنب إصابته. وباستخدام محقنة سعة 1 مل مع إبرة مقاس 27، وعلى مدى فترة تتراوح من 30 إلى 60 ثانية، يتم حقن 100 µL من الخلايا في طرف الطحال المكشوف. وفي نهاية عملية الحقن، يتم وضع مشبك دقيق (micro-clip) على الطحال قبل سحب الإبرة، وذلك لمنع تسرب معلق الخلايا المحقون، ويترك المشبك في مكانه لمدة خمس دقائق.

بعد خمس دقائق من الحقن، استخدم جهاز كي يدوي لإجراء عملية استئصال للطحال من أجل وقف النزف. ابدأ من سرة الطحال في الجانب الأمامي عن طريق التخثير المسبق للجانب القريب من الأوعية الدموية مع الأنسجة الدهنية المجاورة. قد يحدث نزيف طحالي في موقع الحقن.

يتم وضع المشبك الدقيق (micro-clip) على الطحال لمنع تسرب الخلايا الورمية والسيطرة على النزيف الطحالي. يمكن أن تشمل طرق إيقاف النزيف الكي، أو الضغط المستمر لمدة ثلاث إلى خمس دقائق، أو الربط الجراحي بالخياطة إذا لزم الأمر. يتم إغلاق جدار البطن باستخدام خيط جراحي مضفر قابل للامتصاص بمقاس 5.0 وغرزة أفقية واحدة.

بعد ذلك، استخدم خيط جراحة أحادي الخيط غير قابل للامتصاص بمقاس 4.0 لإغلاق الجلد، وذلك أيضاً بغرزة أفقية واحدة. راقب الحيوان بعد العملية الجراحية، وفقاً لبروتوكول النص. ولإجراء التصوير بالتلألؤ البيولوجي، وبعد تخدير الفئران وفقاً لبروتوكول النص، احقن الحيوانات داخل الصفاق بـ 150 µL من لوسيفيرين اليراع الذي تم تحضيره مسبقاً.

ضع الفئران في جهاز IVIS بوضعية الاستلقاء الظهري مع وضع فواصل بين الحيوانات لتقليل الإشارة المنتقلة إلى الفئران المجاورة. بعد ثلاث دقائق من حقن اللوسيفيرين، وبعد تشغيل جهاز IVIS، اختر luminescent، ووقت تعريض لمدة ثانية واحدة، و medium binning. انقر فوق زر Acquire لبدء التصوير، مع التأكد من إجراء التصوير باستمرار بعد ثلاث دقائق من حقن اللوسيفيرين.

بعد الحصول على الصورة، وظهور نافذة الصورة ولوحة الأدوات، انقر فوق أدوات ROI واختَر رقماً من واحد إلى خمسة من أيقونة الدائرة بما يتوافق مع عدد الفئران التي تم تصويرها. ولتحديد مناطق ROI، قم برسم دائرة حول منطقة الإشارة للوميض الحيوي في التجويف البطني للفأر، ثم انقر فوق قياسات ROI كوحدة تعسفية للإشعاع. قم بتضمين دائرة ROI إضافية للخلفية.

بعد أربعة أسابيع من الحقن، ولإجراء التصوير المقطعي بالتألق الضوئي المنتشر، أو DLIT، بعد تشغيل نظام IVIS، اختر Imaging Wizard، ثم Bioluminescence، وانقر على Next. اختر DLIT وانقر على Next. ثم اختر Firefly Probes، وانقر على Next.

اختر Mouse كـ Image Subject، و Auto كـ Exposure Parameter C-13، و Centimeter كـ Field of View، و 0.5 Centimeter كـ Subject Type، ثم انقر على Next. بعد ذلك، انقر على زر Acquire لبدء التصوير. وبعد الحصول على الصورة، اختر علامة التبويب DLIT 3D Reconstruction الموجودة ضمن علامة التبويب Analyze، وانقر على Reconstruct لإنشاء صورة إعادة البناء ثلاثية الأبعاد.

انقر فوق "Tools" ثم "3D Animation". بعد ذلك، من نافذة "3D Animation"، اختر "Spin CCW on Y-Axis". انقر فوق "Record" ثم "Save" لحفظ الملف بتنسيق mov.

لإجراء التصوير الفلوري خارج الجسم (ex vivo)، بعد حصاد وتشريح أكباد الفئران وفقاً للبروتوكول النصي، قم بقياس شدة الفلورية لكل مستعمرة ورمية باستخدام جهاز IVIS. يتم ذلك من خلال اختيار Fluorescence، وزمن تعريض (Exposure Time) مدته أربع ثوانٍ، وMedium Binning، وقيمة 2 لفتحة العدسة (F/Stop)، و535 لمرشح الإثارة، و580 لمرشح الانبعاث. اضغط على زر Acquire لبدء التصوير.

بعد الحصول على الصورة، حدد موقع نافذة الصورة في لوحة الأدوات (Tool Palette). انقر فوق أدوات تحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI Tools)، واختَر 1 من أيقونة الدائرة. ولتحديد المناطق ذات الاهتمام (ROIs)، قم برسم دائرة حول منطقة الإشارة لمستعمرات الورم الفردية في الصورة.

قم بتحديد دائرة منطقة اهتمام (ROI) إضافية للخلفية، ثم انقر فوق قياسات منطقة الاهتمام (Measurements of the ROI) كواحدة اعتبارية من وحدات الإشعاع. حدد دائرة منطقة اهتمام (ROI) إضافية للخلفية. وأخيرًا، قم بإجراء الحسابات وفقًا للبروتوكول المكتوب.

كما هو موضح هنا عن طريق التلألؤ البيولوجي، بعد ثلاثة أسابيع من الحقن في الطحال، أظهرت سلالات HCT116 L2T P1 وP2 عبئاً ورمياً أكبر، مقارنة بالسلالتين O1 وO2. وأشارت هذه البيانات إلى أن السلالتين O1 وO2 يمكن أن تحاكيا المرض قليلة النقاليات، بينما تمثل P1 وP2 استعماراً نقيلًا عدوانياً واسع الانتشار في الكبد. وأكد تقدير الفلورة خارج الجسم للكبد، بعد أربعة أسابيع من الحقن في الطحال، أن P1 وP2 امتلكتا شدة فلورية أعلى مقارنة بأكباد O1 وO2. كما حدد الوسم الفلوري للسلالات الورمية عدد وأحجام المستعمرات النقيلية الفردية في الكبد.

بشكل عام، كانت الصور الفلورية خارج الجسم متوافقة مع النتائج العيانية، ولكن تم الكشف عن المستعمرات الصغيرة المخفية تحت السطح بشكل أفضل بواسطة التصوير الفلوري. وكما هو موضح هنا، تم حساب وقياس أعداد وأحجام المستعمرات النقيلية في كل كبد، وأُجري التصوير الفلوري خارج الجسم لكل مستعمرة نقيلية لكل نسيلة. وكما تظهر هذه الرسوم البيانية، كان العدد الإجمالي للنقائل في P1 أعلى مقارنة بـ P2 وO1 وO2، بينما كان متوسط حجم المستعمرات الفردية في P2 أكبر منه في P1 وO1 وO2. يوفر نموذجنا نهجاً لتحديد جينات إقناع جديدة مرتبطة بالتباين الجزيئي للنقائل.

يمكن استخدام هذه الجينات كأهداف لنهج جديدة في علاج الانتقال الورمي. كما يمكن استخدام نموذجنا للتحقق من صحة جينات مختلفة، سواء كانت مشفرة للبروتينات أو غير مشفرة، والتي تظهر في قواعد البيانات السريرية الضخمة الحالية ولكن لم يتم تحديد وظيفتها بعد في سياق المرض النقيلي. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة بسبب دقة الجراحة الحيوانية.

ومع ذلك، يمكن تحقيق نتائج جيدة في وقت قصير من خلال الممارسة. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر اتباع إرشادات جراحة الحيوان، والتحكم بدقة في النزيف، ومنع تسرب معلق الخلايا الورمية.