إدارة مستدامة للMitogens β-خلية لالفشوت ماوس سليمة

الهدف العام من هذا البروتوكول هو استخدام الكريات الدقيقة من حمض البولي (لاكتيك-كو-جليكوليك) أو PLGA، لإيصال المركبات ذات الأهمية إلى جزر بنكرياسية سليمة ومستزرعة لدراسة تأثيرات المركبات الفردية على تكاثر خلايا بيتا البنكرياسية البالغة. يمكن استخدام هذه الطريقة لاختبار مجموعة متنوعة من المركبات التي يتم إيصالها موضعياً وبطريقة التحرر المستدام إلى الجزر السليمة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه الطريقة في إمكانية تكييفها بسهولة مع مواد حيوية بديلة للإيصال، أو مركبات أخرى ذات أهمية، أو مقايسات نهائية مختلفة.

تمتلك هذه الطريقة أيضاً القدرة على إيصال المركبات ذات الأهمية بالتزامن مع عملية نقل الجزر البنكرياسية المعتمدة في الجسم الحي. ستقوم تايلور كافانا، طالبة الدراسات العليا في مختبري، بتوضيح كيفية تحضير الكرات الدقيقة من PLGA. ابدأ بإضافة 1 mg من المركب ذي الأهمية الموُسّم فلورياً إلى 100 µL من الماء منزوع الأيونات لتكوين المرحلة المائية الأولى.

بعد ذلك، قم بإذابة 65 milligrams من PLGA في 750 microliters من dichloromethane في وعاء وميضي (scintillation vial)، وعرض الخليط للموجات فوق الصوتية لمدة تتراوح من 10 إلى 30 ثانية بقدرة 160 watts لإذابة PLGA تماماً. وبذلك تتكون الطور الزيتي. أضف كامل الطور المائي الأول إلى الطور الزيتي على شكل قطرات.

ثم استخدم مجنسًا يدويًا لاستحلاب المحلول بسرعة 20,000 rpm لمدة 30 ثانية، لتكوين الطور المائي-الزيتي الأول. بعد ذلك، أضف كامل الطور المائي-الزيتي الأول قطرة تلو الأخرى إلى 15 milliliters من محلول PVA بتركيز 1% وقم بالاستحلاب كما تم توضيحه للتو. ثم انقل الحجم الكامل للمستحلب إلى دورق مستدير القاع سعة 200 milliliter واستخدم مبخرًا دوارًا لإزالة المذيب لتوليد الطور المائي عند فراغ قدره 635 millimeters of mercury لمدة ساعة واحدة.

قم بتوزيع ملليلتر واحد من الطور المائي في كل أنبوب من 14 أنبوب طرد مركزي دقيق، ثم قم بترسيب الكرات المجهرية عن طريق الطرد المركزي. عند انتهاء عملية الدوران، استخدم ماصة دقيقة لإزالة 900 ميكرولتر من المحلول المائي من كل أنبوب، مع الحرص على عدم تعكير الرواسب. اغسل الكرات المجهرية في ملليلتر واحد من الماء منزوع الأيونات، يليه إزالة دقيقة لـ 900 ميكرولتر من السائل الطافي.

ثم أضف 900 µL من الماء منزوع الأيونات إلى الـ 100 µL المتبقية من السوائل الطافية. بعد ذلك، قم بالرج باستخدام جهاز الفورتكس والسونيكات لفترة وجيزة لإعادة تعليق الرواسب. بعد عزل الجزر من الحيوانات التجريبية المستهدفة، قم بزراعة 40 جزيرة متطابقة في الحجم ظاهرياً في بئر واحدة من طبق زراعة أنسجة يحتوي على 96 بئراً في 200 µL من وسط زراعة الجزر.

في صباح اليوم التالي، أعد تعليق حصة واحدة من الكريات المجهرية في وسط ما قبل المقايسة، بحيث يكون التركيز النهائي للمركب المستهدف في الأنبوب 10 nanograms per microliter، ثم قم بمعالجة الكريات المجهرية بالموجات فوق الصوتية في حمام مائي مثلج لمدة 10 minutes بقدرة 160 watts مع نبضات مدتها 10 second عند درجة حرارة four degrees Celsius. بعد ذلك، قم بإزالة 100 microliters من وسط زراعة الجزر بعناية من كل بئر دون تحريك الجزر من مكانها، واحضن المزارع مع 100 microliters من وسط المقايسة الذي يحتوي على الكريات المجهرية. وبعد مرور ثلاثة أيام، تخلص بعناية من وسط المقايسة من جميع الآبار دون إزعاج الجزر، واغسل الجزر بلطف في 200 microliters من PBS مرتين.

تلتصق الجزر بشكل ضعيف فقط بصفيحة ذات 96 بئراً. لذلك، من الضروري إزالة الوسط وPBS بلطف من كل بئر حتى لا يتم إزاحة الجزر والتخلص منها عن طريق الخطأ. بعد الغسلة الثانية، اغمر الجزر بلطف في 100 microliters من محلول trypsin EDTA لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة، مع إجراء عملية سحب ودفع لطيفة بالمصّة بعد مرور دقيقتين.

انقل الحجم الكامل لكل بئر إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة منفصلة وأضف 400 microliters من وسط زراعة الجزر لكل أنبوب لإيقاف عملية التفكك. بعد جمع الجزر المعالجة بالكرات الدقيقة عن طريق الطرد المركزي، استخدم ماصّة دقيقة لإزالة السوائل الطافية برفق وأعد تعليق الرواسب في 200 microliters من وسط زراعة جزر جديد. ثم قم بتدوير الجزر المفككة على شرائح مجهرية مشحونة باستخدام جهاز الطرد المركزي الخلوي.

بعد التجفيف بالهواء، ارسم مربعاً حول الجزر باستخدام قلم تحديد كاره للماء، ثم ثبت الخلايا في 75 microliters من البارافورمالدهيد بتركيز أربعة بالمائة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 minutes، يتبع ذلك غسلتان باستخدام 75 microliters من PBS. وبعد الغسلة الثانية، قم بنفاذ الخلايا باستخدام 75 microliters من 0.2%Triton X-100 في PBS لمدة 10 minutes، ثم غسلة نهائية بـ 75 microliters من PBS وحده. ولتوسيم الجزر مناعياً، ابدأ بوضع الشرائح بحيث يكون جانب الخلايا للأعلى في غرفة رطبة وقم بإزالة PBS.

بعد ذلك، يتم منع الارتباط غير النوعي باستخدام 75 µL من مصل الحمار الطبيعي في درجة حرارة الغرفة. وبعد مرور ساعة واحدة، استبدل المصل بـ 75 µL من الجسم المضاد الأولي المطلوب لمدة ساعة أخرى في درجة حرارة الغرفة. وفي نهاية فترة الحضن، اسحب محلول الجسم المضاد الأولي بعناية واغسل العينات باستخدام غسلات PBS بحجم 375 µL.

بعد ذلك، تُحضن الجزر مع 75 µL من الجسم المضاد الثانوي المناسب والموسوم بالفلورسنت المناعي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الحماية من الضوء. وفي نهاية فترة التحضين، يتم استبدال محلول الجسم المضاد الثانوي بـ 75 µL من Dappy لمدة ثلاث دقائق، يليه شطف بالماء منزوع الأيونات لمدة خمس دقائق. وعند انتهاء عملية الغسل، توضع قطرة بحجم 100 µL من محلول تثبيت سريع الجفاف يحتوي على كاشف مضاد للبهتان على غطاء شريحة زجاجية، ثم تُقلب شريحة مجهرية واحدة، بحيث يكون جانب العينة للأسفل، فوق محلول التثبيت.

ستكون أكبر نسبة من الكريات المجهرية بقطر يتراوح بين 1-10 ميكرون، على الرغم من أن بعض الكريات المجهرية قد تكون أكبر حجماً. بعد تشتيت الجزر التي عولجت بكريات PLGA المجهرية السليمة وعملية الوسم المناعي اللاحقة، من الشائع ملاحظة مناطق في العينة خالية من أي وسم بين الخلايا، وذلك بسبب الكريات المجهرية السليمة التي لم يتم إزالتها تماماً خلال خطوات الغسيل. بعد التصوير، يمكن قياس النسبة المئوية للخلايا الموجبة لـ Ki67 والانسولين باستخدام برامج تحليل الصور، أو عن طريق العد اليدوي للعدد الإجمالي للخلايا الموصومة.

تؤدي معالجة الجزر السليمة بكرات مجهرية من PLGA محملة بعامل نمو الأنسجة الضامة البشري المؤتلف لمدة ثلاثة أيام، كما تم توضيحه للتو، إلى زيادة في تكاثر خلايا بيتا، مما يثبت أن البروتين لا يفقد أيًا من وظائفه أثناء عملية تحضير الكرات المجهرية. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن الحصول على النتائج في أقل من أسبوع إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر أن التأثير على تكاثر خلايا بيتا في تجربتك سيختلف بناءً على المركب المستخدم وحركية التحرر الدقيقة للكرات المجهرية التي تم تحضيرها.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل الزرع المشترك للميكروسفيرات المُحملة بالمركب مع جزر بنكرياسية سليمة، لمعالجة تساؤلات أخرى مثل مدى قدرة المركب المعني على تحفيز تكاثر خلايا بيتا في الجسم الحي. يمتلك PLGA تاريخاً من الاستخدام في الأجهزة وأنظمة توصيل الأدوية المعتمدة من قبل FDA، لذا فهو يمثل خياراً جيداً للباحثين والأطباء الذين يسعون إلى توصيل حمولات علاجية إلى أنسجة محددة على مدى فترة زمنية ممتدة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنتاج ميكروسفيرات PLGA المُحملة بالمركب وكيفية إعطائها للجزر السليمة المستنبتة.

لا تنسَ أن العمل مع البارافورمالدهيد قد يكون خطيراً للغاية، وأنه يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة، عند تنفيذ هذا الإجراء.