Name: تقنيات التصوير طليعة الطور والطورية من الانقسام الاختزالي الأول في مجال الاتصالات الأرضية ذبابة الفاكهة البويضات (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: تعلم تقنيات التصوير المناعي لبويضات Drosophila لدراسة تجميع المغزل وتوجيه الكروموسومات أثناء الانقسام الاختزالي الأول. تتيح هذه الطريقة للباحثين فهم آليات ثنائية القطبية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر كريستيان لينر على توفير الجسم المضاد CENP-C وإريك جويس على التوصيات بشأن FISH. تم تمويل العمل في مختبر McKim بمنحة من المعاهد الوطنية للصحة (GM101955).

<ol><li>Bridges, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-disjunction+as+proof+of+the+chromosome+theory+of+heredity%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-disjunction as proof of the chromosome theory of heredity.</a> Genetics. 1 (1), 1-52 (1916).</li>
<li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+err+%28meiotically%29+is+human%3A+the+genesis+of+human+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li>
<li>Theurkauf, W. E., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+spindle+assembly+in+Drosophila+females%3A+behavior+of+nonexchange+chromosomes+and+the+effects+of+mutations+in+the+nod+kinesin-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Meiotic spindle assembly in Drosophila females: behavior of nonexchange chromosomes and the effects of mutations in the nod kinesin-like protein.</a> J Cell Biol. 116 (5), 1167-1180 (1992).</li>
<li>Zou, J., Hallen, M. A., Yankel, C. D., Endow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microtubule-destabilizing+kinesin+motor+regulates+spindle+length+and+anchoring+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A microtubule-destabilizing kinesin motor regulates spindle length and anchoring in oocytes.</a> J Cell Biol. 180 (3), 459-466 (2008).</li>
<li>Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+a+role+for+heterochromatin+in+meiotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation.</a> Cell. 86 (1), 135-146 (1996).</li>
<li>Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congression+of+achiasmate+chromosomes+to+the+metaphase+plate+in+Drosophila+melanogaster+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes.</a> Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).</li>
<li>Gilliland, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+transiently+sequesters+mps1+and+polo+to+collagenase-sensitive+filaments+in+Drosophila+prometaphase+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hypoxia transiently sequesters mps1 and polo to collagenase-sensitive filaments in Drosophila prometaphase oocytes.</a> PLoS One. 4 (10), e7544(2009).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Radford, S. J., Hoang, T. L., Głuszek, A. A., Ohkura, H., McKim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+and+End-On+Kinetochore+Attachments+Are+Coordinated+to+Achieve+Bi-orientation+in+Drosophila+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Lateral and End-On Kinetochore Attachments Are Coordinated to Achieve Bi-orientation in Drosophila Oocytes.</a> PLoS Genet. 11 (10), e1005605(2015).</li>
<li>Smurnyy, Y., Toms, A. V., Hickson, G. R., Eck, M. J., Eggert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binucleine+2%2C+an+isoform-specific+inhibitor+of+Drosophila+Aurora+B+kinase%2C+provides+insights+into+the+mechanism+of+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Binucleine 2, an isoform-specific inhibitor of Drosophila Aurora B kinase, provides insights into the mechanism of cytokinesis.</a> ACS Chem Biol. 5 (11), 1015-1020 (2010).</li>
<li>Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activation+of+Drosophila+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro activation of Drosophila eggs.</a> Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).</li>
<li>Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+meiotic+divisions+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes.</a> Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).</li>
<li>Tavosanis, G., Llamazares, S., Goulielmos, G., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+gamma-tubulin+in+the+acentriolar+female+meiotic+spindle+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Essential role for gamma-tubulin in the acentriolar female meiotic spindle of Drosophila.</a> EMBO J. 16 (8), 1809-1819 (1997).</li>
<li>Endow, S. A., Komma, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+dynamics+during+meiosis+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spindle dynamics during meiosis in Drosophila oocytes.</a> J Cell Biol. 137 (6), 1321-1336 (1997).</li>
<li>Matthies, H. J., Clarkson, M., Saint, R. B., Namba, R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMatthies%2C+HJ+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 67-85 (2000).</li>
<li>Colombié, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+roles+of+Incenp+crucial+to+the+assembly+of+the+acentrosomal+metaphase+spindle+in+female+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dual roles of Incenp crucial to the assembly of the acentrosomal metaphase spindle in female meiosis.</a> Development. 135 (19), 3239-3246 (2008).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

انطلاق ذبابة الفاكهة البويضات على الرغم من أن جسيم نووي ممدود غالبا ما ينظر في البويضات طليعة الطور التالي، وذلك باستخدام جسيم نووي شكل للتمييز طليعة الطور التالي من البويضات الطورية يمكن أن يكون مشكلة. خلال طليعة الطور التالي، يبدأ جسيم نووي كما شكل دائري، يستطيل، ومن ثم تتراجع إلى شكل دائري مع اقتراب البويضة اعتقال الطورية. وهذا يعني أن العديد من البويضات طليعة الطور التالي لم يكن لديك...

توصف دراسة الانقسام الاختزالي أحيانا بأنها "علم الوراثة في علم الوراثة". وذلك لأن الخصائص الأساسية لوراثة الكروموسوم والتشكيلة المستقلة تتم من خلال فصل الكروموسومات أثناء إنتاج الأمشاج. جاء عرض مهم لنظرية الكروموسوم للوراثة في عام 1916 من عمل كالفن بريدجز في ذبابة الفاكهة السوداء1. ساهمت هذه الدراسات وغيرها من دراسات علم الوراثة الكلاسيكية في ذبابة الفاكهة بشكل كبير في فهمنا لعلم الوراثة. ومع ذلك ، كان الفحص الخلوي للكروموسومات الانتصافية في ذبابة الفاكهة البويضات أمرا صعبا. ويرجع ذلك في المقام الأول إلى أن التألق المناعي لبويضات ذبابة الفاكهة في المرحلة المتأخرة ، عندما يتجمع المغزل ويتم توجيه الكروموسومات للفصل ، يعوقه وجود أغشية تجعل البويضة غير قابلة للاختراق للأجسام المضادة.
 على الرغم من هذا التحدي ، تظل بويضات ذبابة الفاكهة نموذجا جذابا لدراسة سلوك الكروموسوم وتجميع المغزل. هذا بسبب الأدوات الجينية القوية المتوفرة في ذبابة الفاكهة ، ولكن أيضا لأن البويضات تتوقف عند الطور الأول ، عندما تكون الكروموسومات موجهة والمغزل يتشكل بالكامل. هذا يسهل جمع وفحص أعداد كبيرة من البويضات في هذه المرحلة المهمة من انقسام الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للكائن الحي النموذجي البسيط القابل للتلاعب الجيني لدراسة فصل كروموسومات البويضات أن يوفر مساهمة مهمة في فهمنا للصحة الإنجابية للإنسان. الأخطاء في عدد الكروموسوم هي السبب الوراثي الرئيسي للإجهاض والعيوب الخلقية لدى البشر2. يمكن إرجاع غالبية هذه الأخطاء إلى البويضة وترتبط بزيادة عمر الأم. يتزايد متوسط عمر الأمهات في الولايات المتحدة ، مما يجعل هذا مصدر قلق كبير للصحة العامة.
 نصف هنا طرق الفحص الخلوي لذبابة الفاكهة البويضات ، بما في ذلك عرض توضيحي لكيفية إزالة أغشية البويضات. هذه الطرق هي تعديلات على البروتوكولات التي وصفها Theurkauf و Hawley3 و Zou et al.4 ، وديرنبورغ وآخرون.5. نقوم أيضا بتضمين طرق لإثراء مراحل مختلفة من البويضات ، بناء على بروتوكول وصفه لأول مرة جيليلاند وآخرون.6. أخيرا ، نضيف تعليمات للعلاج الدوائي لبويضات ذبابة الفاكهة. تسمح هذه الطرق معا بالتحقيق الخلوي لفصل كروموسوم البويضة وتجميع المغزل في ذبابة الفاكهة.

<table><tbody><tr><td>أنابيب مخروطية 15 مل</td><td>مختلفة</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16٪ فورمالديهايد</td><td>تيد بيلا ، Inc.</td><td>18505</td><td>خطرة ؛ بمجرد فتحها ، تخلص منها بعد شهر</td></tr><tr><td>واحد 250 مل أكواب</td><td>مختلفة</td><td></td><td></td></tr> 5 <tr><td>مل أنابيب</td><td></td><td></td><td></td></tr> مختلفة <tr><td>خميرة</td><td></td><td></td> جافة نشطة <td>مختلفة مع الماء لعمل عجينة قوام زبدة الفول</td></tr><tr><td>السوداني المضادة للجسم المضاد ألفا توبولين المقترن ب FITC</td><td>Sigma</td><td>F2168</td><td>استنساخ DM1A</td></tr><tr><td>ثنائي النوكلين 2</td><td>خلاط سيجما</td><td>B1186</td><td>الخطير</td></tr><tr><td>ألبومين مصل الأبقار</td><td></td><td></td> المتنوع سيجما A4161 <td></td></tr><tr><td>كلوريد الكالسيوم</td><td>مختلف</td><td></td><td></td></tr><tr><td>الكولشيسين</td><td>سيجما</td><td>C-9754</td><td>أغطية خطرة</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>رقم 1 1/2</td></tr><tr><td></td><td></td> كبريتات ديكستران مختلفة <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>مختلف</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ملقط</td><td></td><td></td></tr><tr><td>مختلف</td><td></td><td></td>من<td>الإيثانول</td></tr><tr><td></td><td>تيد بيلا ، وشركة</td><td>5622</td><td>ملاقط دومون عالية الدقة على الطراز 5</td></tr><tr><td>فورماميد</td><td>سيجما</td><td>47670-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>شرائح زجاجية</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>جلوكوز</td><td>أنابيب متدرجة</td><td></td><td></td></tr><tr><td>مختلفة 1.5 مل</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>EM-5330</td><td>متوفرة من العديد من البائعين</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>كلوريد المغنيسيوم المختلفة</td><td></td><td></td></tr><tr><td>الميثانول</td><td></td> مختلف شبكة كبيرة مختلفة <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> (~ 1،500 & micro;<td></td><td></td></tr><tr><td> م)</td> <td>VWR</td><td>AA43657-NK</td><td>مجموعة متنوعة من التنسيقات والموردين الآخرين ، 12 أو 14</td></tr><tr><td>شبكة صغيرة (~ 300 & مايكرو ؛ م)</td> <td>مختبرات الطيف</td><td>146 424</td><td>مجموعة متنوعة من التنسيقات ، على سبيل المثال ، 146 422 أو 146 486</td></tr><tr><td>nutator</td><td>ماصات باستور</td><td></td><td></td></tr> مختلفة <tr><td>أسيتات البوتاسيوم</td><td></td> حمض الكاكوديليك المختلفة <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>C0125</td><td>DANGEROUS ؛ بدلا من ذلك ، يمكن استبدال كاكوديلات الصوديوم</td></tr><tr><td></td><td></td> بالبوتاسيوم <td></td><td></td></tr><tr><td> هيدروكسيد</td> أسيتات <td>الصوديوم المختلفة</td><td></td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم</td><td></td> المختلفة سترات الصوديوم المختلفة <td></td><td></td></tr><tr><td>هيدروكسيد الصوديوم</td><td></td> السكروز المختلف <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> تاكسول مختلف (باكليتاكسل) سيجما T1912 الخطرة <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>تريتون X-100</td><td>فيشر</td><td>PI-28314</td><td></td></tr><tr><td>توين 20</td><td>فيشر</td><td>PI-28320</td><td></td></tr><tr><td>دوامة</td><td>مختلفة</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

تقنيات التصوير طليعة الطور والطورية من الانقسام الاختزالي الأول في مجال الاتصالات الأرضية<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; البويضات

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

فصل الكروموسومات في البويضات البشرية عرضة للخطأ ، مما يؤدي إلى اختلال الصيغة الصبغية ، وهو السبب الوراثي الرئيسي للإجهاض والعيوب الخلقية. تحمل دراسة سلوك الكروموسوم في البويضات من الكائنات الحية النموذجية الكثير من الوعد للكشف عن الأساس الجزيئي لقابلية البويضات البشرية لاختلال الصيغة الصبغية. ذبابة الفاكهة السوداء قابلة للتلاعب الجيني ، مع أكثر من 100 عام من البحث والمجتمع وتطوير التقنية. ومع ذلك ، فإن تصور سلوك الكروموسوم وتجميع المغزل في ذبابة الفاكهة يواجه تحديات خاصة ، ويرجع ذلك في المقام الأول إلى وجود أغشية تحيط بالبويضة لا يمكن اختراقها للأجسام المضادة. نصف هنا بروتوكولات جمع وإعداد وتصوير تجميع مغزل الانقسام الاختزالي الأول وسلوك الكروموسوم في ذبابة الفاكهة البويضات ، والتي تسمح بالتشريح الجزيئي لفصل الكروموسوم في هذا الكائن الحي النموذجي المهم.

سوف الأساليب التي وصفناها هنا يؤدي إلى مجموعة من المراحل المتأخرة من البويضات ذبابة الفاكهة تمثل ثلاث مراحل الانقسام الاختزالي (الشكل 1). وتتميز البويضات في الطور الأول من وجود الغلاف النووي، وهو أمر واضح بسبب عدم وجود إشارة تويولين في المنطقة المحيطة جسيم نووي (الشكل 1A). طليعة الطور التالي هو فترة ما بعد انهيار الغلاف النووي خلالها تجميع المغزل. خلال طليعة الطور التالي، وجسيم نووي يفترض الشكل المميز، لتص...

نقدم بروتوكولات لجمع وإعداد وتصوير بويضات ذبابة الفاكهة الناضجة. تسمح هذه الطرق بتصور سلوك الكروموسوم وتجميع المغزل ووظيفته أثناء الانقسام الاختزالي.

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير بويضات ذبابة Drosophila للفحص الخلوي لتجمع المغزل وتوجه الكروموسومات أثناء الانقسام الاختزالي الأول. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الانقسام الاختزالي، مثل كيفية إنشاء ثنائية قطبية المغزل وكيف تصبح الكروموسومات ثنائية التوجه في غياب المركزات. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إزالة أغشية البويضة التي تمنع تغلغل الأجسام المضادة بشكل فعال، مما يسمح بإجراء التألق المناعي. للبدء، قم بطلاء الجزء الداخلي من أنبوب سعة خمسة مليمترات وماصة باستور مسبقاً باستخدام PTB لمنع التصاق البويضات بالأسطح.أضف 100 milliliters من محلول ROB المنظم إلى خلاط، ثم أضف من 100 إلى 300 من الذباب المخدر وقم بتشغيل الخلاط بنظام النبضات ثلاث مرات لمدة ثانية واحدة. قم بتصفية المزيج الناتج في بيكر سعة 250-milliliter من خلال مصفاة ذات مسامات يبلغ قطرها حوالي 1,500 micrometers. اترك الرشاحة لتترسب لمدة دقيقتين تقريبًا، ثم قم بشفط الطبقة العليا مع إزالة أكبر قدر ممكن من أجزاء الجسم الكبيرة.قم بترشيح الملاط مرة أخرى في دورق سعة 250 مل، وذلك عبر مصفاة أصغر ذات حجم مسام يبلغ 300 µm. اشطف الدورق الأول باستخدام محلول منظم إضافي في الماصة المطلية لتجميع البويضات المتبقية. اترك الملاط ليترسب لمدة ثلاث دقائق، ثم اسحب جميع السوائل باستثناء 10 مل من القاع.اسكب أكبر قدر ممكن من الـ 10 milliliters في الأنبوب المغلف سعة خمسة milliliters. اترك المعلق يستقر لمدة دقيقتين تقريبًا، ثم قم بإزالة السائل بعناية. أضف ما تبقى من الـ 10 milliliters من المعلق، واترك الخليط يستقر مرة أخرى قبل إزالة السائل.اشطف أي بويضات متبقية خارج الكأس باستخدام محلول منظم إضافي في الماصة المطلية. اترك سائل الشطف يستقر في أنبوب سعة خمسة مليليتر لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق. لتثبيت المبيضان، قم أولاً بسحب كل السوائل من الأنسجة وأضف فوراً واحد مليليتر من Fix Mix.ضع الأنسجة على جهاز هزاز دوراني (nutator) لمدة 2 1/2 دقيقة. بعد ذلك، أضف 1 mL من الهيبتان، وقم برج الأنبوب باستخدام جهاز الفورتيكس (vortex) لمدة دقيقة واحدة، ثم اترك البويضات تترسب لمدة دقيقة إضافية. قم بإزالة جميع السوائل من النسيج المترسب، ثم أضف 1 mL من محلول 1x PBS.قم برجّ الأنبوب بجهاز vortex لمدة 30 ثانية، ثم اترك البويضات لتترسب لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، أزل كل السائل من الأنبوب واملأه بخمسة ملليلتر من 1x PBS. وباستخدام الماصة المطلية، أضف ما يقرب من 500 إلى 1,000 بويضة إلى شريحة زجاجية مغشاة.أزل أي أجزاء أو مواد زائدة من الجسم باستخدام الملقط. ضع شريحة غطاء فوق النسيج وقم بدحرجة البويضات برفق حتى تتم إزالة جميع الأغشية. ويُعد سحب حافة شريحة الغطاء عبر البويضات طريقة فعالة.تحقق من تقدم عملية إزالة الغشاء تحت المجهر بشكل دوري. إذ سيؤدي الضغط المفرط إلى تدمير البويضات. ويتحقق الإزالة الأكثر فعالية لغشاء البويضة من خلال الجمع بين أقصى قدر من حركة البويضة وأقل قدر من الضغط.استخدم لمسة خفيفة وحركات سريعة لسحب حافة غطاء الشريحة عبر البويضات. لبدء عملية الاستخلاص والحجب، أضف 15 milliliters من PBS 1%Triton X-100 إلى أنبوب سعة 50-milliliter. اشطف البويضات المجمعة في هذا الأنبوب وقم بهزها حركياً لمدة تتراوح بين 1 1/2 إلى ساعتين.بعد ترك البويضات لتترسب لمدة دقيقتين، قم بإزالة السائل مع أكبر قدر ممكن من الأغشية، ثم أضف 50 milliliters من PBS 0.05%Triton X-100. اترك البويضات تترسب لمدة دقيقتين إضافيتين، ثم قم بإزالة كل السائل باستثناء حوالي one milliliter. انقل البويضات إلى أنبوب مدرج سعة 1.5 milliliter وقم بإزالة السائل المتبقي.أضف 1 mL من PTB لعملية الحجب، ثم ضع العينات على جهاز الهزاز الدوار (nutate) لمدة ساعة واحدة. تخلص من السائل الموجود في البويضات، ثم أضف 300 µL من PTB. بعد ذلك، أضف الجسم المضاد الأولي المطلوب بالتخفيف المناسب، مع الحرص على حماية العينات المعالجة بالأجسام المضادة الفلورية من الضوء.تُحضن الخلايا البويضية طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. تُغسل البويضات بـ 1 mL من PTB أربع مرات لمدة 15 دقيقة في كل مرة. يُزال السائل، ثم يُضاف 200 µL من الطافي الخاص بالأجنة المعالجة بالأجسام المضادة الثانوية.قم بترشيح العلامة التي تبلغ 300 µL باستخدام PTB، ثم قم بالتحريك الدوراني (nutation) لمدة تتراوح من ثلاث إلى أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة. اغسل البويضات مرة واحدة لمدة 15 دقيقة باستخدام 1 mL من PTB. بعد ذلك، قم بإزالة السائل وأضف 0.5 µL من Hoechst 33342 و 500 µL من PTB.اضبط الجهاز على وضع التدوير (nutation) لمدة سبع دقائق. استخدم 1 mL من PTB لغسل البويضات مرتين لمدة 15 دقيقة في كل مرة. يمكن الآن تثبيت العينات وتصويرها فوراً باستخدام تقنيات المجهر البؤري (confocal microscopy) القياسية، أو تخزينها في PTB عند درجة حرارة 4 °C حتى وقت الحاجة إليها.تظهر هنا صور للبويضات في مراحل متأخرة تم إنتاجها باستخدام التقنية الموضحة، وهي تجسد ثلاث مراحل مختلفة من الانقسام المنصف. وتتميز البويضات في الطور التمهيدي بوجود الغلاف النووي الذي يمكن رؤيته بسبب غياب إشارة التوبولين في المناطق المحيطة بالجسم النووي. كما لوحظ الاستطالة المميزة للجسم النووي في الطور التمهيدي الاستوائي، وتظهر الكروموسومات الأربعة منفصلة عن كتلة الجسم النووي.تم التقاط الطور الاستوائي أيضاً، حيث يظهر الكاريوسوم منكمشاً على شكل دائري. هنا يبرز التلوين المناعي باستخدام أجسام مضادة مختلفة المغزل، والسنتروميرات، والمغزل المركزي في البويضات المثبتة بالفورمالديهايد والهبتان. وأظهرت البويضات المعالجة بعقار Colchicine أنماطاً ظاهرية غير قياسية مع اختفاء معظم الأنيبيبات غير الحركية، مما أدى إلى تلامس جميع الأنيبيبات مع DNA عند السنترومير المسمى Phocyde.أدى العلاج باستخدام Paclitaxel إلى ظهور بويضات تحتوي على أنيببات دقيقة مفرطة في السيتوبلازم. وأخيراً، أظهرت البويضات المعالجة بـ Binucleine 2 لتثبيط Aurora B kinase فقداناً تاماً لأنيبيبات المغزل. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر عدم التسرع أثناء إزالة غشاء البويضة، لأن نجاح البروتوكول يعتمد على هذه الخطوة.بشكل عام، سيواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات، لأن إزالة الأغشية تتطلب الصبر والممارسة. ولذلك، فإن أفضل طريقة لتعلم هذه التقنية هي مشاهدة شخص يؤديها بنجاح. وبمجرد إتقانها، يمكن إتمام عملية دحرجة البويضات في غضون 5 إلى 10 دقائق.ولكن من الممكن أن تستغرق العملية ما يصل إلى 30 دقيقة دون التأثير على جودة النتائج. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير بويضات Drosophila في مراحلها المتأخرة لتصوير تجميع المغزل الحيوي، وتنظيم المغزل، وحركات الكروموسومات، والتوجيه الثنائي للكروموسومات. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.

techniques-for-imaging-prometaphase-metaphase-meiosis-i-fixed

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يصف هذا البروتوكول استخدام microinjection وعالية الدقة في...

تقنيات Microinjection لدراسة الانقسام الميتوزي في ذبابة الفاكهة السوداء البطن الأجنة المخلوي

البويضات عرضة لعدم توازن الصبغيات بسبب أخطاء في العزل الصبغي خلال نضوج الانتصافي. البيض يمكن أن تسبب العقم مختل الصيغة الصبغية ، والإجهاض ، أو اضطرابات النمو مثل متلازمة داون. هنا ، نحن تصف طرق لإدخال المواد المختارة في البويضات وأساليب لدراسة وتقييم النضج الانتصافي الصيغة الصبغية.

الماوس Microinjection سيت ، والنضج وتقييم الصيغة الصبغية

وkinetochore هو المكان الذي يبدأ SAC الاشارة رصد الفصل الإنقسامية من chromatids شقيقة. تم وصف طريقة لتصور التوظيف ودوران واحد من البروتينات kinetochore والتنسيق مع الحركة في...

دراسة حاجز الميتوزى بواسطة يوضح الحيوي Kinetochore السلوك البروتين والحركة كروموسوم في المعيشة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الجنين المخلوي

يمكن أن يكون التلوين المناعي لذبابة الفاكهة في المرحلة المتأخرة أمرا صعبا بسبب الأغشية المحيطة بالبويضات. يصف هذا الفيديو طريقة عالية الإنتاجية للحصول على البويضات وتثبيتها وإزالة الأغشية للتلوين المناعي. يوضح البروتوكول المميز هذه التقنيات مع البويضات في المرحلة المتأخرة المستخدمة لتصور مراحل مختلفة من الانقسام الاختزالي.

تحضير بويضات ذبابة الفاكهة الثابتة للتلوين المناعي: طريقة عالية الإنتاجية لإصلاح وإزالة الغشاء الخارجي

التصوير من البروتينات centrosomal خلال ذبابة الفاكهة الحيوانات المنوية هو وسيلة قوية لتحديد بروتينات جديدة الحرجة للبيولوجيا الجسيم المركزي وكذلك لتوضيح وظيفة معينة من اللاعبين المعروفين في هذه العملية.

Centrosomes التصوير في يطير الخصية

وصفت وسائل لعزل وإعداد ذبابة الفاكهة الخصيتين عينات (العيش وثابتة) للتصوير من قبل على النقيض من المرحلة ومضان المجهري في هذه الوثيقة.

تحليل الخلوي الحيوانات المنوية: الأعمال التحضيرية لايف والثابتة من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخصية

هذه المخطوطة تعرض طريقة مفصلة لتوليد X-تحقيقات ذراع الكروموسوم والمنفذ fluorescence في الموقع التهجين (الأسماك) فحص حالة الأخت التماسك تشروماتيد في بروميتافاسي والطوريه اعتقلت  المورفولوجية بويضات. هذا البروتوكول مناسبة لتحديد ما إذا كان الذراع هو التماسك سليمة أو تعطل في الأنماط الجينية المختلفة.

استخدام Fluorescence في الموقع التهجين (الأسماك) لرصد حالة التماسك الذراع في بروميتافاسي والطوريه وأنا بويضات المورفولوجية

المتغيرات الجينية المرتبطة بأمراض الإنسان تبدأ لتصبح كشف، تزداد أهمية وضع نظم لتقييم سرعة الأهمية البيولوجية لتلك المتغيرات التي تم تحديدها. ويصف هذا البروتوكول الأساليب لتقييم وظيفة الجينات البشرية أثناء الانقسام الاختزالي الإناث الأول باستخدام بويضات الماوس.

استخدام الماوس بويضات لتقييم وظيفة الجينات البشرية أثناء الانقسام الاختزالي أنا

الأخطاء الانتصافية في نقاط الاشتباك العصبي وإعادة التركيب شائعة في بويضات الثدييات. يعد التحليل الدقيق للبروتينات المشاركة في هذه العمليات أمرا ضروريا لفهم كيف ولماذا يحدث تكوين البويضات بشكل خاطئ في كثير من الأحيان. تسمح التقنيات المعروضة هنا بمراقبة شاملة لإعادة التركيب والمشابك لتقييم جودة البويضات في الفئران.

تحضير انتشار الكروموسوم الانتصافي من بويضات الفئران لتقييم التشابك وإعادة التركيب

جرحشاعثزرحشرتاد مضان التصوير المقطعي يعمل خارج حدود اختراق الأنسجة sectioning المجهري مضان. وتستند هذه التقنية على التعددية إسقاط الإضاءة والنقل وصفا الفوتون. علينا أن نظهر في الجسم الحي ، كامل الجسم التصور 3D من التشكل من GFP - معربا عن أقراص تخيلي في...

جرحشاعثزرحشرتاد الإسفار عن التصوير المقطعي في الجسم الحي. تصوير النامية ذبابة الفاكهة</em

تعلم تقنيات التصوير المناعي لبويضات Drosophila لدراسة تجميع المغزل وتوجيه الكروموسومات أثناء الانقسام الاختزالي الأول. تتيح هذه الطريقة للباحثين فهم آليات ثنائية القطبية.

تقنيات التصوير طليعة الطور والطورية من الانقسام الاختزالي الأول في مجال الاتصالات الأرضية

استكشف المزيد من الفيديوهات