إزالة ذبابة الفاكهة الأنسجة العضلية من اليرقات شرائح التحليل المناعي من العصبونات الحسية وخلايا البشرة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إزالة الأنسجة العضلية من يرقة ذبابة الفاكهة استعدادا لتحليل التألق المناعي لليرقات أو الأشجار المتغصنة أو الخلايا العصبية وأنسجة البشرة. اليوم ، سنعرض طريقة تعمل على تحسين تصور العوامل العصبية والعوامل العصبية الإضافية المشاركة في تكوين التغصنات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتصوير المناعي للبروتينات ، التي تحجبها الأنسجة العضلية ، وتحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، وتمكن من استخدام الفحص المجهري فائق الدقة.

للبدء ، أضف كمية كافية من المحلول الملحي البارد إلى طبق مطاط سيليكون لتغطية السطح السفلي. أضف يرقة الموضوع إلى الطبق وضعها تحت المجهر الاستريو. ضمان وضع الضوء بشكل صحيح.

ضع اليرقة مع الجانب البطني لأعلى ، والذي يمكن التعرف عليه بواسطة أحزمة أسنان البطن. قم بتمديد اليرقة في الاتجاه الخلفي الأمامي ، وباستخدام دبابيس الحشرات ، قم بتثبيت الرأس والذيل في قاع الطبق. باستخدام مقص تشريح ناعم ، قم بقصه على طول خط الوسط البطني لليرقة من طرف إلى آخر.

انشر اليرقة مفتوحة وقم بتثبيت أنسجة البشرة في الزوايا الأربع بحيث تكون مسطحة. باستخدام الملقط ، قم بإزالة الأعضاء الداخلية ، بما في ذلك الجهاز العصبي المركزي والأمعاء والقصبة الهوائية. اضبط دبابيس الحشرات بحيث يتم تدريس الفيليه ولكن لا يتم تمديده إلى أقصى حد.

حدد موقع خط الوسط الظهري لليرقة ، حيث تكون الأنسجة العضلية غائبة ، ثم ضع شقة ملقط في الجزء الداخلي من هذه الحدود. حرك الشق بين العضلة والبشرة ، مع الحرص على تقليل ملامسة البشرة لتقليل الضرر الذي يلحق بالبشرة ، قم بالتشريح بأكبر الشوكات الممكنة ، وحاول تشريح الكالسيوم المحتوي على محلول ملحي. يمكن أن يساعد ذلك في خلق مسافة بين العضلات والبشرة.

بعد ذلك ، اسحب الملقط لأعلى لكسر ارتباط العضلة بجدار الجسم عند نقطة تثبيت واحدة. كرر هذه العملية لأجزاء العضلات المتبقية ذات الأهمية. أعد ضبط دبابيس الحشرات لتمديد شرائح اليرقات إلى أقصى حد في جميع الاتجاهات.

لإصلاح الفيليه ، قم أولا بإزالة المحلول الملحي ، ثم أضف 4٪ فورمالديهايد البارد الطازج في PBS ، لتغطية قاع الطبق. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة. اشطف الفيليه خمس مرات في PBS لإزالة الفورمالديهايد الزائد.

بعد ذلك ، استخدم الملقط لسحب الأنسجة العضلية بعناية من نقاط التثبيت المتبقية. مرة أخرى ، تقليل ملامسة البشرة. أخيرا ، قم بفك الفيليه وإزالته من طبق التشريح.

ضعه في أنبوب نظيف من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل. يجب إجراء مزيد من الغسيل والحجب والتلوين المناعي في هذا الأنبوب. لتركيب فيليه للتصوير ، قم بإزالة العينة من أنبوب الطرد المركزي الدقيق وقم بتوجيهه السطحي الداخلي لأسفل على زلة غطاء في قطرة من PBS.

قطع الرأس والذيل. ثم قم بإزالة PBS عن طريق امتصاصه بمسح معملي. أضف قطرة واحدة من Antifade Mountant.

ضع شريحة مجهر على زلة الغطاء، ثم اضغط برفق باستخدام منديل مختبري لتفريق وسط التثبيت. اقلب الجانب وضع طلاء أظافر شفاف على كل حافة لإغلاق زلة الغطاء. تظهر هذه الصور متحدة البؤر تجارب التألق المناعي لتصور بروتين تقاطع الحاجز ، أو Coracle ، أو Cora ، و da الخلايا العصبية.

هنا ، تم التقاط صور للعضلات التي تمت إزالتها والأنسجة العضلية السليمة في ظل نفس ظروف طاقة الليزر. في الأنسجة العضلية السليمة ، تمت زيادة قوة الليزر للتعويض عن تداخل العضلات ، وإنتاج صورة مماثلة. في الصور التي تم الحصول عليها من شرائح العضلات التي تمت إزالتها ، يمكن اكتشاف الكورا بوضوح عند حدود خلايا البشرة في مسارات متقطعة على طول التشعبات العصبية من الفئة الرابعة.

وتحديد الخلايا العصبية ، سوما. في المقابل ، كان توطين الكورا في هذه المجالات بالكاد يمكن اكتشافه في العضلات على العينات. هنا ، تم تصور الكورا إلى حد كبير في العضلات والقصبة الهوائية والوصلات العصبية العضلية ، وحجبت التألق من هذه الأنسجة معظم الكورا في البشرة.

تم تصوير العينات أيضا باستخدام الفحص المجهري للإضاءة الهيكلية ثلاثية الأبعاد لتحديد ما إذا كانت إزالة العضلات قد حسنت التصور بدقة أعلى. مرة أخرى ، احتاجت عينات العضلات السليمة إلى التصور مع زيادة القوة ووقت التعرض للتعويض عن تداخل العضلات. بدت دقة الصورة أكثر وضوحا في عينات العضلات ، ولوحظ عدد أقل من القطع الأثرية ، وتم حل تلطيخ الكورا لمسارات التغصنات بسهولة أكبر.

يمكن أيضا قياس أغشية التغصنات عند 114 نانومتر في حالة إيقاف تشغيل العضلات. بينما يبدو أنها تبلغ 272 نانومتر في العضلات على الفيليه. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم الحد من عدد اليرقات التي تم تشريحها قبل التثبيت ، بحيث لا يزيد الوقت المنقضي عن 25 دقيقة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إزالة الأنسجة العضلية من ذبابة الفاكهة يرق. سيساعد هذا البروتوكول في تحليل التألق المناعي للخلايا العصبية الحسية لليرقات وخلايا البشرة التي تبتكرها. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.