Name: طريقة لقياس الحمض النووي الريبي N 6 -methyladenosine تعديلات في الخلايا والأنسجة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: اكتشف تقنية النورثرن بلوت المُعدّلة لقياس تعديلات m6A في الحمض النووي الريبي من أنسجة الفئران. تتيح هذه الطريقة الكشف الفعّال عن التعديلات الريبوزومية والرسول والصغيرة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C.Y.W. تلقى الدعم من المعهد الوطني للبحوث الصحية (NHRI-EX101-9925SC) ، والمجلس الوطني للعلوم (101-2314-B-182-100-MY3 ، 101-2314-B-182A-009) ، ومستشفى تشانغ غونغ التذكاري (CMRPG3B1643 و CMRPG3D1002 و CMRPG3D0581 و CMRPG380091 و CMRPG3C1763).

<ol><li>Thammana, P., Held, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+16S+RNA+during+ribosome+assembly+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Methylation of 16S RNA during ribosome assembly in vitro.</a> Nature. 251 (5477), 682-686 (1974).</li>
<li>Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+epitranscriptome%3A+N6-methyladenosine+and+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).</li>
<li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyl-adenosine+%28m6A%29+in+RNA%3A+an+old+modification+with+a+novel+epigenetic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">N6-methyl-adenosine (m6A) in RNA: an old modification with a novel epigenetic function.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (1), 8-17 (2013).</li>
<li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+FTO+in+adipose+tissue+decreases+Angptl4+translation+and+alters+triglyceride+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Loss of FTO in adipose tissue decreases Angptl4 translation and alters triglyceride metabolism.</a> Sci Signal. 8 (407), 127(2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li>
<li>Berulava, T., Rahmann, S., Rademacher, K., Klein-Hitpass, L., Horsthemke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-adenosine+methylation+in+MiRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">N6-adenosine methylation in MiRNAs.</a> PLoS One. 10 (2), 0118438(2015).</li>
<li>Deng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+occurrence+of+N6-methyladenosine+in+bacterial+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Widespread occurrence of N6-methyladenosine in bacterial mRNA.</a> Nucleic Acids Res. 43 (13), 6557-6567 (2015).</li>
<li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+N-methyladenosine+methylome+in+eukaryotic+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The dynamic N-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>Fustin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-methylation-dependent+RNA+processing+controls+the+speed+of+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA-methylation-dependent RNA processing controls the speed of the circadian clock.</a> Cell. 155 (4), 793-806 (2013).</li>
<li>Geula, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells.+m6A+mRNA+methylation+facilitates+resolution+of+naive+pluripotency+toward+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stem cells. m6A mRNA methylation facilitates resolution of naive pluripotency toward differentiation.</a> Science. 347 (6225), 1002-1006 (2015).</li>
<li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTO+modulates+fibrogenic+responses+in+obstructive+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy.</a> Sci Rep. , SREP18874 (2016).</li>
<li>Jia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine+in+nuclear+RNA+is+a+major+substrate+of+the+obesity-associated+FTO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO.</a> Nat Chem Biol. 7 (12), 885-887 (2011).</li>
<li>Du, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+association+study+of+the+m6A+genes+with+major+depressive+disorder+in+Chinese+Han+population%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">An association study of the m6A genes with major depressive disorder in Chinese Han population.</a> J Affect Disord. 183, 279-286 (2015).</li>
<li>Wang, C. Y., Yeh, J. K., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Wen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythm+of+RNA+N6-methyladenosine+and+the+role+of+cryptochrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythm of RNA N6-methyladenosine and the role of cryptochrome.</a> Biochem Biophys Res Commun. 465 (1), 88-94 (2015).</li>
<li>Wang, C. Y., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Tsai, M. L., Wen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTO+modulates+circadian+rhythms+and+inhibits+the+CLOCK-BMAL1-induced+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">FTO modulates circadian rhythms and inhibits the CLOCK-BMAL1-induced transcription.</a> Biochem Biophys Res Commun. 464 (3), 826-832 (2015).</li>
<li>Heyn, H., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Adenine+Code+for+DNA%3A+A+Second+Life+for+N6-Methyladenine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine.</a> Cell. 161 (4), 710-713 (2015).</li>
<li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+m%286%29A+Reader+YTHDC1+Regulates+mRNA+Splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear m(6)A Reader YTHDC1 Regulates mRNA Splicing.</a> Mol Cell. 61 (4), 507-519 (2016).</li>
<li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+mRNA+methylation+reveals+enrichment+in+3%27+UTRs+and+near+stop+codons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons.</a> Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).</li>
<li>Horowitz, S., Horowitz, A., Nilsen, T. W., Munns, T. W., Rottman, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+N6-methyladenosine+residues+in+bovine+prolactin+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mapping of N6-methyladenosine residues in bovine prolactin mRNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (18), 5667-5671 (1984).</li>
<li>Resnick, R. J., Noreen, D., Munns, T. W., Perdue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+N6-methyladenosine+in+expression+of+Rous+sarcoma+virus+RNA%3A+analyses+utilizing+immunoglobulin+specific+for+N6-methyladenosine%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Nucleic+Acid+Res+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of N6-methyladenosine in expression of Rous sarcoma virus RNA: analyses utilizing immunoglobulin specific for N6-methyladenosine.</a> Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 29, 214-218 (1983).</li>
<li>Golovina, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+site-specific+detection+of+m6A+nucleoside+presence+in+RNA+based+on+high-resolution+melting+%28HRM%29+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Method for site-specific detection of m6A nucleoside presence in RNA based on high-resolution melting (HRM) analysis.</a> Nucleic Acids Res. 42 (4), 27(2014).</li>
<li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+of+the+human+and+mouse+m6A+RNA+methylomes+revealed+by+m6A-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq.</a> Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).</li>
<li>Linder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide-resolution+mapping+of+m6A+and+m6Am+throughout+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome.</a> Nat Methods. 12 (8), 767-772 (2015).</li>
<li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Quantification+of+Methylated+Cytidine+and+Adenosine+in+Cellular+and+Tissue+RNA+by+Nano-Flow+Liquid+Chromatography-Tandem+Mass+Spectrometry+Coupled+with+the+Stable+Isotope-Dilution+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Quantification of Methylated Cytidine and Adenosine in Cellular and Tissue RNA by Nano-Flow Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with the Stable Isotope-Dilution Method.</a> Anal Chem. 87 (15), 7653-7659 (2015).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondenaturing+agarose+gel+electrophoresis+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), 5445(2010).</li>
<li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTO+modulates+fibrogenic+responses+in+obstructive+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy.</a> Sci Rep. 6, 18874(2016).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+mapping+reveals+reversible+and+dynamic+N-methyladenosine+methylome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N-methyladenosine methylome.</a> Nat Chem Biol. , (2016).</li>
<li>Sanschagrin, S., Yergeau, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+of+16S+ribosomal+RNA+gene+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons.</a> J Vis Exp. (90), (2014).</li>
<li>Kukutla, P., Steritz, M., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+ribosomal+RNA+for+mosquito+gut+metagenomic+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Depletion of ribosomal RNA for mosquito gut metagenomic RNA-seq.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li>
<li>Mishima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-Northern+Blotting%3A+Detection+of+RNA+Modifications+by+Using+Antibodies+against+Modified+Nucleosides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Immuno-Northern Blotting: Detection of RNA Modifications by Using Antibodies against Modified Nucleosides.</a> PLoS One. 10 (11), 0143756(2015).</li>
<li>Klungland, A., Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+RNA+modifications+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Dynamic RNA modifications in disease.</a> Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

تعديلات الحمض النووي الريبي لها أدوار مهمة في الوظيفة الخلوية وعلم وظائف الأعضاء. لا يزال الفهم الحالي لتنظيم هذه التعديلات ووظيفتها ووازنها قيد الاستكشاف والتوسع8. لذلك ، هناك حاجة إلى طريقة دقيقة وذهبية لتقييم تعديلات الحمض النووي الريبي. توفر طريقة النشاف الشمالي المعدلة تقديرا كميا دقيقا لتعديلات الحمض النووي الريبي وتحديدا واضحا للتعديلات في الحمض النووي الريبي المتنوع. على الرغم من أن الطريقة تتطلب 3 أيام على الأقل ، إلا أنه يمكن توحيدها ويمكن استخدامها في تصميمات تجريبية مختلفة. علاوة على ذلك ، مع الأجسام المضادة المختلفة ، يمكنه اكتشاف تعديلات مختلفة على الحمض النووي الريبي27.
من المهم فصل الحمض النووي الريبي المختلفة عند تحليل تعديلات الحمض النووي الريبي. يشتمل الحمض النووي الريبي الريبوزومي على جزء كبير من الكمية الإجمالية لل RNA28,29. ستمثل نتائج تحليل تعديلات الحمض النووي الريبي فقط في إجمالي الحمض النووي الريبي في الغالب تغيرات الحمض النووي الريباسي. يمكن أن تخفي المثيلة وغيرها من التعديلات المماثلة للحمض النووي الريبي التغييرات في الحمض النووي الريبي الأخرى. من خلال إجراء فصل الهلام ، يمكن تحليل تعديلات mRNA وغيرها من الحمض النووي الريبي الصغير بشكل أكثر دقة.
يوفر رسم الخرائط على مستوى النسخ باستخدام الترسيب المناعي والتسلسل m6A نظرة ثاقبة مفصلة لتعديل كل نوع من أنواع الحمض النووي الريبي22. يوفر معلومات عن الحمض النووي الريبي المحدد ودقة حوالي 80-120 نقطة أساس. على الرغم من أن m6A-Seq يمكنه مقارنة التعديلات بين الظروف التجريبية المختلفة ، إلا أن اختيار المعايير والضوابط المناسبة لمثل هذه التجارب أمر صعب18. يصعب إعادة إنتاج الترسيب المناعي ، وغالبا ما يعطي اختلافات كبيرة بين التكرارات. علاوة على ذلك ، يتطلب m6A-Seq تجزئة عينات الحمض النووي الريبي قبل الترسيب المناعي والتسلسل30. من المحتمل أن تؤدي عملية التجزئة إلى تأثيرات لا داعي لها على تعديلات الحمض النووي الريبي الأصلية. إذا كانت التجربة لا تحتاج إلى معلومات الجين المحدد ولكنها تتطلب شروطا مختلفة للمقارنة ، فإن الطريقة الحالية توفر تصورا وتحكما أفضل للإعدادات التجريبية المتنوعة. 
يعد تعديل الحمض النووي الريبي خطوة مهمة في تنظيم التحكم في النسخ31. ومع ذلك ، فإن التوازن والآليات التنظيمية لتعديلات الحمض النووي الريبي المختلفة في ظل عوالم فسيولوجية متنوعة لا تزال غير واضحة. باستخدام طريقة النشاف الشمالي المعدلة الحالية ، يمكن قياس تعديلات الحمض النووي الريبي المختلفة ومقارنتها. علاوة على ذلك ، يمكن التحقيق في التغييرات واللوائح الخاصة بتعديلات الحمض النووي الريبي بمزيد من التفصيل. في المستقبل ، قد يكون من الممكن أيضا الجمع بين البيانات التجريبية من كل من النشاف الشمالي الكلاسيكي وبروتوكولات النشاف الشمالي المعدلة ، مما يوفر رؤى أكبر في بيولوجيا الحمض النووي الريبي.
العامل الأكثر أهمية الذي يحدد نجاح بروتوكول النشاف الشمالي المعدل هو سلامة عينة الحمض النووي الريبي. قد تؤدي الحمض النووي الريبي مع قدر من التدهور إلى نتائج نشاف شمالية كلاسيكية جيدة ، ولكن من المحتمل أن يكون لهذا تأثير كبير على نتائج النشاف الشمالي المعدلة. يمكن أن تختلف تعديلات الحمض النووي الريبي في الأنسجة أو خطوط الخلايا المختلفة بشكل كبير. من المهم اختبار أحمال عينة الحمض النووي الريبي المناسبة للأنسجة المختلفة قبل إجراء التجارب النهائية.
نظرا لأن إجراءات النشاف قد سميت تقليديا على اسم الدكتور الجنوبي والاتجاهات الجغرافية المختلفة ، فإننا نقترح اسم النشاف "الشمالي الشرقي" للتقنية الحالية.

تلعب تعديلات الحمض النووي الريبي الديناميكية والقابلة للانعكاس أدوارا مهمة في توازن الحمض النووي الريبي. قبل أربعة عقود ، وجد أن تعديلات N 6-methyladenosine (m6A) وفيرة في النسخ حقيقية النواة1. لديهم وظائف متنوعة في الحمض النووي الريبي المرسال (mRNA) ، والحمض النووي الريبي الريبوسومي (rRNA) ، والحمض النووي الريبي النووي الصغير ، ونقل الحمض النووي الريبي ، والحمض النووي الريبيالميكروي 2. تؤثر تعديلات m6A ل mRNA على التضفير3 ، والترجمة4 ، والتدهور5 ، والتوطين2. علاوة على ذلك ، فإنها تؤثر على التكوين الحيوي للريبوسوم ووظيفة الحمض النووي الريبيالصغير 6. لوحظ الحفظ التطوري ل m6A تعديلات الحمض النووي الريبي في البكتيريا أحادية الخلية إلى البشر متعدد الخلايا7. يخضع تحديد أدوار تعديلات m6A حاليا لاستكشاف مكثف. من المتوقع أن توفر الجهود رؤى جديدة حول التحكم في النسخ. تكشف الدراسات الحديثة أن التعديلات الكيميائية الأخرى ل mRNA8 تلعب أيضا أدوارا حاسمة في استقلاب الحمض النووي الريبي. 
 إيقاعات الساعة البيولوجية9 ، تعدد القدرات للخلايا الجذعية10 ، استقلاب الدهونالثلاثية 4 ، التليف11 ، السمنة12 ، والاكتئاب الشديد13 هي أمثلة قليلة على العمليات التي من المعروف فيها أن تعديلات m6A تتحكم في النتائج. تحتوي العديد من نصوص جينات الساعة البيولوجية على م6مواقعA 14. يؤدي تعديل م6أ ميثيلاز أو ديميثيلاز إلى تغييرات في الفترة اليومية15. Mettl3 ، وهو m6A transferase ، هو منظم لتعدد القدرات في الخلايا الجذعية. يؤدي نقص Mettl3 إلى الفتك الجنيني المبكر وتحضير النسب الشاذ في مرحلة ما بعد الزرع10. يؤثر نقص كتلة الدهون والسمنة المرتبطة (FTO) ، و m6A demethylase ، في الخلايا الشحمية على تعبئة الأحماض الدهنية ووزن الجسم من خلال تنظيم ما بعد النسخ ل Angptl44. تكشف هذه الدراسات أن m6A لا يتحكم فقط في معالجة mRNA ، ولكنه يلعب أيضا أدوارا حاسمة في التطور الجنيني وعلم وظائف الأعضاء المرضية. وظيفة التعديلاتm 6A لها آثار على الاعتبارات العلاجية في المستقبل.
تتوفر عدة طرق لقياس m6A تعديلات الحمض النووي الريبي16-18. تقليديا ، يتم استخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) والكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) لدراسة توزيع m6A في العديد من الحمض النووي الريبي19،20. قياس الطيف الكتلي هو أداة حساسة للكشف عن تعديلات m6A في الحمض النووي الريبي. ومع ذلك ، يحتاج الحمض النووي الريبي إلى استئصال بواسطة RNase إلى أجزاء قصيرة قبل التحليل بواسطة قياس الطيف الكتلي21. ترسيب ومتسلسل مناعي ميثيل الحمض النووي الريبي (م6A-Seq) 22 يترسب مناعية الحمض النووي الريبي المجزأ مع الأجسام المضادة الخاصةب m 6A ويقوم بتسلسل الحمض النووي الريبي المتوازي. تولد هذه الطريقة مناظر طبيعية بعرض النسخm 6A. رسم خرائط عالية الدقة ل m6A الربط المتقاطع والترسيب المناعي بدقة النوكليوتيدات الفردية (miCLIP) يرسم خرائط إضافية ل m6A التعديلات بدقة نوكليوتيداتواحدة 23. توفر كلتا الطريقتين تفاصيل تعديل m6A عبر النسخ بأكمله ، مع معلومات جينات محددة. ومع ذلك ، فإن التقديرات الكمية والتوحيد القياسي في كلتا الطريقتين يصعب إذا كانت التجارب تتطلب مقارنة شروط متعددة. علاوة على ذلك ، فإن تجزئة الحمض النووي الريبي ل m6A-Seq تغير بنية الحمض النووي الريبي الأصلية ، والتي قد تؤثر على مستويات m6A الأصلية. للكشف عن تعديلات m6A العالمية للحمض النووي الريبي وتغيراتها في ظل ظروف تجريبية مختلفة ، أبلغنا عن طريقة تستخدم بروتوكول نشاف شمالي معدل. تعمل هذه الطريقة على حل الحمض النووي الريبي عن طريق الوزن الجزيئي ، باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام18. يوفر هذا الإجراء توحيدا وتقديرات كمية أفضل للتجارب التي تتضمن شروطا أو عينات متعددة. كما يوفر معلومات تعديل m6A محددة للحمض النووي الريبي المختلفة ، سواء كانت rRNA أو mRNA أو microRNA.

<table><tbody><tr><td>حل RNaseZap</td><td>بروتوكول Ambion</td><td>AM9782</td><td>1.1</td></tr><tr><td>حل كاشف TRI</td><td>بروتوكول</td><td>AM9738</td><td>1.2.1.1</td></tr><tr><td>1-Bromo-3-chloropropane (BCP) بروتوكول</td> <td>Sigma</td><td>B9673</td><td>1.2.1.3</td></tr><tr><td>بروتوكول الإيثانول</td><td>JTbaker</td><td>8006</td><td>1.2.1.3</td></tr> بروتوكول <tr><td>الأيزوبروبانول</td><td>سيجما</td><td>I9516</td><td>1.2.1.3</td></tr><tr><td>GenElute mRNA Miniprep Kit</td><td>بروتوكول Sigma</td><td>MRN70</td><td>1.2.2.1</td></tr><tr><td>بروتوكول الجليكوجين</td><td>أمبيون</td><td>AM9510</td><td>1.2.2.2</td></tr><tr><td>أسيتات الصوديوم</td><td>فلوكا</td><td>71183</td><td>البروتوكول 1.2.2.2</td></tr><tr><td>المياه الخالية من النوكلياز</td><td>بروتوكول أمبيون</td><td>AM9930</td><td>1.2.2.6</td></tr><tr><td>بروتوكول DEPC</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>2.1.1</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>JT Baker</td><td>بروتوكول A426</td><td>2.1.2</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>بروتوكول Sigma</td><td>M1254</td><td>2.1.3</td></tr><tr><td>محلول الفورمالديهايد 37٪</td><td>بروتوكول Sigma</td><td>F8775</td><td>2.1.3</td></tr><tr><td>EDTA ، ملح ثنائي الصوديوم</td><td>JT Baker</td><td>8993</td><td>البروتوكول 2.1.3 10x MOPS عازلة</td></tr><tr><td>فورماميد</td><td>Sigma</td><td>F7503</td><td>البروتوكول 2.2.1</td></tr><tr><td>RNA علامة الألفية</td><td>Ambion</td><td>AM7150</td><td>البروتوكول 2.2.2</td></tr><tr><td>بروتوكول الإيثيديوم بروميد</td><td>أمريسكو</td><td>X328</td><td>2.2.5</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0300-10</td><td>البروتوكول 2.2.5 صبغة التتبع</td></tr><tr><td>بروموفينول الأزرق</td><td>سيجما</td><td>114391</td><td>البروتوكول 2.2.5 صبغة تتبع</td></tr><tr><td>الزيلين سيانول FF</td><td>سيجما</td><td>X4126</td><td>البروتوكول 2.2.5 صبغة التتبع</td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم ثنائي هيدرات</td><td>جي تي بيكر</td><td>3624</td><td>البروتوكول 2.4.2 20x SSC عازلة</td></tr> سترات <tr><td>ثلاثي الصوديوم</td><td>سيجما</td><td>S1804</td><td>بروتوكول 2.4.2 20x SSC عازلة</td></tr><tr><td>Hybond Blotting Paper</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN6101M</td><td>Protocol 2.4.4</td></tr><tr><td>GE Hybond-N + غشاء</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303B</td><td>Protocol 2.4.6</td></tr><tr><td>ستراتالينكر الأشعة فوق البنفسجية Crosslinker 2400</td><td>ستراتاجين</td><td>400075</td><td>بروتوكول 3.1.2</td></tr><tr><td>Gel Catcher 1500</td><td>ANT Technology</td><td>Gel Catcher 1500</td><td>Protocol 3.1.5</td></tr><tr><td>Anti-m6A (N6-methyladenosine)</td> <td>أنظمة Synaptic</td><td>202003</td><td>Protocol 3.2.3</td></tr><tr><td>Amersham ECL Anti-Rabbit IgG ، بروتوكول Ab</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934</td> المرتبط ب HRP <td>بالكامل 3.2.5</td></tr><tr><td>نظام ChemiDoc MP</td><td>بروتوكول 1708280 BIO-RAD</td><td></td><td>3.2.8</td></tr></tbody></table>

طريقة لقياس الحمض النووي الريبي<em&gt; n</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine تعديلات في الخلايا والأنسجة

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

N 6-Methyladenosine (m6A) تعديلات الحمض النووي الريبي متنوعة ومنتشرة في كل مكان بين حقيقيات النوى. تحدث في mRNA و rRNA و tRNA و microRNA. كشفت الدراسات الحديثة أن تعديلات الحمض النووي الريبي القابلة للانعكاس هذه تؤثر على تضفير الحمض النووي الريبي وترجمته وتدهوره وتوطينه. يتم أيضا التحكم في العمليات الفسيولوجية المتعددة ، مثل إيقاعات الساعة البيولوجية ، وتعدد القدرات في الخلايا الجذعية ، والتليف ، واستقلاب الدهون الثلاثية ، والسمنة عن طريق تعديلات m6A. يعد الترسيب المناعي / التسلسل ، وقياس الطيف الكتلي ، والنشاف الشمالي المعدل بعض الطرق المستخدمة بشكل شائع لقياس تعديلات m6A. هنا ، نقدم تقنية نشاف شمالية شرقية لقياس تعديلات m6A. يوفر البروتوكول الحالي فصلا جيدا للحمض النووي الريبي ، وتيسيرا أفضل وتوحيدا مناسبا لمختلف التصميمات التجريبية ، وتحديدا واضحا لتعديلات m6A في مصادر مختلفة من الحمض النووي الريبي. في حين أن تعديلات m6A معروفة بأن لها تأثيرا حاسما على فسيولوجيا الإنسان المتعلقة بإيقاعات الساعة البيولوجية والسمنة ، فإن أدوارها في الحالات الفسيولوجية (المرضية) الأخرى غير واضحة. لذلك ، فإن التحقيقات على تعديلات m6A لديها إمكانية هائلة لتوفير رؤى رئيسية في علم وظائف الأعضاء الجزيئي.

بعد 14 يوما في المرحلة الساعة البيولوجية العادية ضوء الظلام، وضعت الفئران من النوع البري في الظلام مستمر. تم أخذ عينات من الرنا من الكبد في 4 فترات ساعة ودرس مع النشاف شمال تعديلها. تم الكشف عن مثيلة من rRNAs، من mRNAs، والرنا صغيرة بشكل واضح (الشكل 2). المقارنة بين أوقات الإيقاعية المختلفة (CT) يمكن أن تحسب بدقة مع المعيار 18S الريباسي. وكان هناك تذبذب الساعة البيولوجية قوية من م 6 والمستويات في الريباسي، مرنا، والرنا الصغيرة. لتجنب التدخل المعروضة من قبل الريباسي، الرنا مذيل بعديد الأدينيلات يمكن تنقيته، كما في الخطوة 1.2.2. بعد تنقيتها، والريباسي يمكن القضاء عليها إلى حد كبير للسماح التصور أفضل من الرنا الأخرى (الشكل 3). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig1.jpg" /> <stron<html> ز&gt; الشكل 1: تجميع وحدة نقل وصمة عار. وأظهرت وحدة نقل الشعرية لالنشاف الحمض النووي الريبي لغشاء. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig2.jpg" /> الشكل 2: إيقاع الساعة البيولوجية للومستويات م 6 في C57BL / 6J الفئران. ويظهر هذا الرقم م 6 وصمة عار من الحمض النووي الريبي مجموع من كبد البرية من نوع الفئران التضحية في اليوم الأول من مرحلة مظلمة الظلام بعد 14 يوما من مرحلة ضوء الظلام العادية في 4 ساعات فترات. وقد تم القياس الكمي باستخدام م 6 فرق كثافة الصورة بين 18S و 28S الريباسي. تم تطبيع م 6 وفرة إلى الفرقة 18S الريباسي من هلام الفورمالديهايد في القاع.وآخرون = &quot;_ فارغة&quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig3.jpg" /> الرقم 3: م 6 والبقع مع أو بدون الريباسي. تمثيلية م ترد 6 والبقع من الحمض النووي الريبي مجموع وRNA مذيل بعديد الأدينيلات من كبد البرية من نوع الفئران. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 1 </td><td colspan="3"> عازلة 10X اجتماعات الأطراف (7.0 درجة الحموضة، وحماية من الضوء) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> اجتماعات الأطراف </td><td> 41.85 </td><td> ز </td><td> 0.2 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> أسيتات الصوديوم </td><td> 4.1 </td><td> ز </td><td>0.05 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> EDTA، الصوديوم الملح </td><td> 3.7 </td><td> ز </td><td> 0.01 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> المياه DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> مجموع </td><td> 1 </td><td> L </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> يقلب في درجة حرارة الغرفة </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="3"> 20x وعازلة SSC (7.0 درجة الحموضة) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> كلوريد الصوديوم </td><td> 175.3 </td><td> ز </td><td> 3 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> سترات الصوديوم </td><td> 88.3 </td><td> ز </td><td> 0.3 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> المياه DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> مجموع </td><td> 1 </td><td> L </td><td></td&gt; </tr><tr><td></td><td colspan="3"> يقلب في درجة حرارة الغرفة، ثم الأوتوكلاف </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="3"> صبغ تتبع </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> عازلة 10X اجتماعات الأطراف </td><td> 500 </td><td> ميكرولتر </td><td> 1X </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Ficoll 400 </td><td> 0.75 </td><td> ز </td><td> 15٪ </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> برموفينول الأزرق </td><td> 0.01 </td><td> ز </td><td> 0.2٪ </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> سيانول زايلين </td><td> 0.01 </td><td> ز </td><td> 0.2٪ </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> المياه DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> مجموع </td><td> 5 </td><td> مل </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> مخزن في -20 ° C </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td colspan="3"> المياه DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> تمييع النسبة 1: 1000 من DEPC في ده 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> يقلب بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، ثم الأوتوكلاف </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="3"> عينة العازلة (حماية من الضوء) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> عازلة 10X اجتماعات الأطراف </td><td> 200 </td><td> ميكرولتر </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 37٪ الفورمالديهايد </td><td> 270 </td><td> ميكرولتر </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> الفورماميد </td><td> 660 </td><td> ميكرولتر </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> مخزن في -20 ° C </td><td></td><td></td><td></td></tr></tboدى&gt; </table> الجدول 1: المخازن المؤقتة والحلول.

ووصف طريقة النشاف شمال المعدلة لقياس N 6 -methyladenosine (م 6 أ) التعديلات في الحمض النووي الريبي. الطريقة الحالية يمكن الكشف عن تعديلات في الرنا متنوعة والضوابط في إطار مختلف التصاميم التجريبية.

طريقة لقياس الحمض النووي الريبي<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine تعديلات في الخلايا والأنسجة

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

الهدف العام من تقنية لطخة نورثرن المعدلة هو قياس تعديلات N6-methyladenosine، المعروفة بـ n6A في الحمض النووي الريبي (RNA)، والكشف عن التعديلات في أنواع مختلفة من الـ RNAs. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية تتعلق بدور علم فوق الجينات الخاص بالـ RNA، مثل تعديلات N6-methyladenosine. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في توفير فصل فعال للـ RNA، ومعايير أفضل للتصاميم التجريبية، وتحديد دقيق لتعديلات n6A في الـ RNAs.يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤى حول تعديلات n6A في RNA، كما يمكن تطبيقها على تعديلات RNA أخرى باستخدام أجسام مضادة كاشفة مختلفة. لبدء التجربة، رُش محلول إزالة تلوث الريبونوكلياز على مناشف ورقية وامسح الماصات وأسطح طاولة المختبر. بلل المناشف الورقية بماء خالٍ من النوكلياز وامسح الماصات وأسطح طاولة المختبر مرة أخرى.احصل على محلول عزل RNA المحفوظ في درجة حرارة 4 °C وأضف 1 mL من المحلول إلى حوالي 75 mg من أنسجة الفأر. استخدم خلاطاً علوياً لتجانس الأنسجة. بعد ذلك، أضف 100 µL من 1-Bromo-3-chloropropane أو BCP لكل 1 mL من متجانس العينة.رج الأنابيب بقوة لمدة 15 ثانية ثم انتقل إلى عملية عزل RNA الكلي. وباستخدام مقياس الطيف الضوئي، حدد تركيز RNA من خلال تسجيل الامتصاصية عند 260 نانومتر و280 نانومتر. تحقق من جودة عينة RNA عن طريق إجراء الرحلان الكهربائي لهلام الأجاروز بتركيز 0.8%.اشطف جميع معدات الرحلان الكهربائي باستخدام ثنائي إيثيل بيروكونات أو ماء DEPC. اخلط 2.5 grams من الأجاروز، ثم 215 milliliters من ماء DEPC في دورق إرلنماير وأذب الخليط تماماً في الميكروويف. بعد ذوبان المحلول، أضف 12.5 milliliters من محلول MOPS buffer بتركيز 10X.وأضف 22.5 milliliters من formaldehyde بتركيز 37% إلى الدورق. ثم صب المحلول في جهاز الفصل الكهربائي باستخدام مشط بسمك 1.5 millimeter. وباستخدام مشط نظيف، ادفع الفقاعات نحو حواف الهلام.اترك الهلام ليتصلب في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، استخدم محلول MOPS المنظم للتشغيل بتركيز 1X الذي تم تحضيره مسبقاً لشطف آبار الهلام وتشغيله تشغيلاً أولياً. قم بتحميل عينات الـ RNA في آبار الهلام، ثم ابدأ بتشغيل الهلام.في اليوم التالي، افحص الهلام وصوره تحت أشعة UV. وللتحضير لعملية النقل، قم بقص الهلام وإزالة الجزء غير المستخدم. حضّر 500 milliliters من محلول saline sodium citrate أو SSC buffer بتركيز 10X.اغسل الهلام مرتين باستخدام محلول SSC المنظم بتركيز 10X. قص ورقة ترشيح واحدة تكون كبيرة بما يكفي لتغطية الهلام. قص أربع قطع من ورق الترشيح بنفس حجم الهلام.بعد ذلك، قم بقص ورقة واحدة من غشاء النايلون موجب الشحنة لتكون بنفس حجم الهلام. ضع علامة (ثلمة) على كل من الهلام والغشاء، لتكون بمثابة مؤشر لضمان التوجيه الصحيح. انقع الغشاء في محلول SSC المنظم بتركيز 2X.صب 500 milliliters من محلول SSC buffer بتركيز 10X في صينية النقل. ضع ورقة الترشيح الكبيرة فوق اللوح الزجاجي وبلل ورقة الترشيح باستخدام محلول النقل. ثم استخدم ماصة لإزالة أي فقاعات هوائية.انقع قطعتين من ورق الترشيح المقطع مسبقاً في محلول نقل (transfer buffer) وضعهما في منتصف ورق الترشيح، ثم قم بإزالة أي فقاعات هوائية. بعد ذلك، ضع الهلام (gel) بحيث يكون الوجه العلوي للأسفل فوق ورق الترشيح، ثم ضع الغشاء (membrane) فوق الهلام، مع التأكد من محاذاة الحزوز الموجودة في كل من الهلام والغشاء.بعد ذلك، ضع قطعتين من ورق الترشيح المقطع مسبقاً فوق الغشاء. قم بإزالة أي فقاعات موجودة بين الطبقات. لف الغشاء بغطاء بلاستيكي لضمان أن المناديل تمتص فقط المحلول المنظم الذي يمر عبر الجل والغشاء.بعد ذلك، ضع مناشف ورقية فوق ورق الترشيح. ضع لوحاً زجاجياً كبيراً فوق المناشف ثم ضع ثقلاً فوق هذه المجموعة واترك الـ RNA ينتقل من الهلام إلى الغشاء طوال الليل. بعد عملية النقل، حافظ على رطوبة الغشاء في محلول منظم 2X SSC.اغمر ورقتين من ورق الترشيح في محلول SSC المنظم بتركيز 10X، ثم ضع الورقتين في جهاز الربط المتقاطع بالأشعة فوق البنفسجية (UV cross linker). تأكد من أن الجانب الممتص لـ RNA متجه للأعلى، ثم ضع الغشاء فوق ورق الترشيح. اختر وضع الربط المتقاطع التلقائي، واضغط على زر البدء لبدء عملية التشعيع.افحص الغشاء والهلام باستخدام جهاز التقاط صور هلام UV للتأكد من نقل RNA من الهلام إلى الغشاء. قم بحجب الغشاء في محلول 5%non-fat milk في منظم TBST عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. قم بحضن الغشاء طوال الليل في محلول m6A antibody عند درجة حرارة أربع درجات Celsius.في اليوم التالي، اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام محلول TBST المنظم لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، قم بتحضين الغشاء في محلول الجسم المضاد لحمار مضاد للأرنب المقترن بـ HRP لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. وبعد مرور ساعة واحدة، اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام محلول TBST المنظم لمدة 15 دقيقة.ضع ركيزة التألق الكيميائي المحسنة. ثم التقط التألق الكيميائي باستخدام جهاز تصوير رقمي. وأخيراً، انتقل إلى تقدير كمية m6A وقياس كثافة التألق الكيميائي لـ m6A النسبية باستخدام برنامج Image J. تم أخذ عينات من حمض RNA من كبد الفأر على فترات زمنية مدتها أربع ساعات ودُرست باستخدام تقنية لطخة نورثرن المعدلة.تم الكشف بوضوح عن مثيلة الـ rRNAs والـ mRNAs والـ RNAs الصغيرة. أُجريت لطخات m6A ممثلة للـ RNA الكلي ولـ RNA الخالي من الـ rRNA من أكباد فئران من النوع البري. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون أربعة أيام إذا تم تطبيقها بشكل صحيح.بعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم فوق الجينات للحمض النووي الريبي (RNA epigenetics) لاستكشاف التأثيرات على الفسيولوجيا البشرية المتعلقة بالإيقاع اليوماوي والسمنة.

a-method-for-measuring-rna-n6-methyladenosine-modifications-cells

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتوصيف البيوكيميائية إنزيم الرنا--تعديل الخميرة، Mod5، ومناقشة كيف يمكن تطبيق هذا البروتوكول على الإنزيمات الأخرى تعديل الحمض النووي الريبي.

تحليل في المختبر للكشف عن النشاط ترانسفيراز إيسوبينتينيل الحمض الريبي النووي النقال

هنا نقدم بروتوكول لشق DNAzyme تعتمد على RNA. وهذا يتيح التحليل السريع والمعتمد على الموقع لRNA 2'-O-methylation. ويمكن استخدام هذا النهج للتقييم الأولي أو الرئيسي لنشاط النورا.

تحليل تعتمد على DNAzyme من rRNA 2'-O-Methylation

هنا، يتم وصف فحص الأجسام المضادة الخالية في المختبر للتحليل المباشر لنشاط ميثيل ترانسفيراز على الحمض النووي الريبي الاصطناعية أو في المختبر.

فحص الأجسام المضادة الحرة لتحليل نشاط الحمض النووي الريبي ميثيل ترانسفيراز

ميثيل الحمض النووي الريبي ميثيل المناعة المقايسة هو طريقة تعتمد على الأجسام المضادة المستخدمة لإثراء لشظايا الحمض النووي الريبي الميثيل. إلى جانب التسلسل العميق ، فإنه يؤدي إلى تحديد النصوص التي تحمل تعديل M5C.

ميثيل الحمض النووي الريبي الفحص المناعي لدراسة m5C التعديل في arabidopsis

ويرد هنا وصف لطريقة دقيقة وقابلة للاستنساخ في النيوكليوسيدات الحية/النيوكليوتيدات في النباتات. يستخدم هذا الأسلوب HPLC-MS/MS.

إعداد عينة النبات لقياس محتوى النيوكليوسيد/النيوكليوتيدات باستخدام جهاز HPLC-MS/MS

يصف البروتوكول الحالي التحضير والقياس الكمي للأرجينين الحر والمرتبط بالبروتين وميثيل أرجينين بواسطة 1التحليل الطيفي H-NMR.

استكشاف ميثيل أرجينين بواسطة التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي

تمثل التعديلات اللاحقة للنسخ للحمض النووي الريبي طبقة غير مدروسة من تنظيم الترجمة التي تم ربطها مؤخرا بمرونة الجهاز العصبي المركزي. هنا ، يتم وصف إعداد العينات ونهج قياس الطيف الكتلي الترادف الكروماتوغرافي السائل للتوصيف المتزامن للعديد من تعديلات الحمض النووي الريبي في الخلايا العصبية المفردة.

توصيف تعديلات الحمض النووي الريبي في الخلايا العصبية المفردة باستخدام مطياف الكتلة

يوفر البروتوكول تعليمات لتعديل الحمض النووي الريبي مع كبريتات ثنائي ميثيل لتجارب التنميط الطفري. ويشمل التحقيق في المختبر وفي الجسم الحي مع طريقتين بديلتين لإعداد المكتبة.

فحص بنية الحمض النووي الريبي مع التنميط الطفري لكبريتات ثنائي ميثيل مع التسلسل في المختبر والخلايا

هنا، نقدم بروتوكولا لتقييم مستويات m⁶A العالمية بشكل شبه كمي باستخدام نقطة النقطة. يتم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي، وتفكيكه، ونشره على غشية نايلون، وفحص بجسم مضاد مضاد ل m⁶A، ويتم رؤيته بواسطة الإضاءة الكيميائية. تعكس شدة الإشارة، التي تم قياسها بواسطة تحليل ImageJ الرمادي، وفرة المثيلة النسبية، مما يوفر سير عمل قابل للتكرار للبحث.

اختبار نقطة النقطة للكشف عن مستويات تعديل الحمض النووي الريبي العالميN 6-ميثيلادينوزين

يوفر هذا البروتوكول نهجا مفصلا لتقييم مستويات تعديل m6A للحمض النووي الريبي المحدد باستخدام MeRIP-qPCR.

اختبار MeRIP-qPCR للكشف عن مستويات تعديلm6A من الحمض النووي الريبي المحدد في خلايا الساركوما العظمية

اكتشف تقنية النورثرن بلوت المُعدّلة لقياس تعديلات m6A في الحمض النووي الريبي من أنسجة الفئران. تتيح هذه الطريقة الكشف الفعّال عن التعديلات الريبوزومية والرسول والصغيرة.

طريقة لقياس الحمض النووي الريبي

استكشف المزيد من الفيديوهات