طريقة لقياس الحمض النووي الريبي N 6 -methyladenosine تعديلات في الخلايا والأنسجة
ديسمبر 5, 2016
ووصف طريقة النشاف شمال المعدلة لقياس N 6 -methyladenosine (م 6 أ) التعديلات في الحمض النووي الريبي. الطريقة الحالية يمكن الكشف عن تعديلات في الرنا متنوعة والضوابط في إطار مختلف التصاميم التجريبية.
الهدف العام لتقنية النشاف الشمالي المعدل هو قياس N6-methyladenosine ، تعديلات n6A في الحمض النووي الريبي واكتشاف التعديلات في الحمض النووي الريبي المتنوع. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في دور علم التخلق الحمض النووي الريبي مثل تعديلات N6-methyladenosine. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر الفصل الفعال للحمض النووي الريبي ، وتوحيدا أفضل للتصميمات التجريبية وتحديدا واضحا لتعديل n6A في الحمض النووي الريبي.
يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لتعديلات n6A في الحمض النووي الريبي ويمكن أيضا تطبيقها على تعديلات الحمض النووي الريبي الأخرى مع أجسام مضادة مختلفة للكشف. لبدء التجربة ، رش محلول إزالة التلوث من الريبونوكلياز على مناشف ورقية وامسح الماصات وأسطح مقاعد المختبر. بلل المناشف الورقية بالماء الخالي من النوكلياز وامسح الماصات وأسطح مقاعد المختبر مرة أخرى.
احصل على محلول عزل الحمض النووي الريبي الذي يتم الحفاظ عليه عند أربع درجات مئوية وأضف ملليلترا واحدا من المحلول إلى حوالي 75 ملليغرام من أنسجة الفأر. استخدم أداة تقليم علوية لتجانس الأنسجة. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من 1-Bromo-3-chloropropane أو BCP لكل مليلتر واحد من عينات متجانسة.
رج الأنابيب بقوة لمدة 15 ثانية وانتقل إلى عزل الحمض النووي الريبي الكامل. باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، حدد تركيز الحمض النووي الريبي من خلال ملاحظة الامتصاص عند 260 نانومتر و 280 نانومتر. تحقق من جودة عينة الحمض النووي الريبي عن طريق إجراء الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز بنسبة 0.8٪.
اشطف جميع معدات الرحلان الكهربائي بماء ثنائي إيثيل بيروكربونات أو DEPC. يمزج 2.5 جرام من الاغاروز ، ثم 215 مل من ماء DEPC في قارورة Erlenmeyer ويذوب الخليط تماما في الميكروويف. بعد ذوبان المحلول ، أضف 12.5 مل من المخزن المؤقت 10X MOPS.
و 22.5 مل من 37 ٪ فورمالديهايد إلى القارورة. ثم صب المحلول في جهاز الرحلان الكهربائي بمشط بسمك 1.5 ملم. باستخدام مشط نظيف ، ادفع الفقاعات إلى حواف الجل.
اسمح للجل بالتصلب في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، استخدم المخزن المؤقت للتشغيل 1X MOPS المعد مسبقا لشطف آبار الجل وتشغيل الجل مسبقا. قم بتحميل عينات الحمض النووي الريبي في آبار الجل ، ثم قم بتشغيل الجل.
في اليوم التالي ، افحص الجل وقم بتصويره تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. لتحضير النقل ، قم بقص الجل وإزالة الجزء غير المستخدم. تحضير 500 مل من سترات الصوديوم المالحة 10X أو المخزن المؤقت SSC.
اغسل الجل مرتين باستخدام عازلة 10X SSC. قص ورقة ترشيح واحدة كبيرة بما يكفي لتغطية الجل. قص أربع قطع من ورق الترشيح بنفس حجم الجل.
بعد ذلك ، قم بقص ورقة واحدة من غشاء النايلون موجب الشحنة بنفس حجم الجل. ضع علامة على الشق على الجل والغشاء كعلامة لضمان الاتجاه الصحيح. انقع الغشاء في 2X SSC عازلة.
صب 500 مل من المخزن المؤقت 10X SSC في صينية النقل. ضع ورقة الترشيح الكبيرة على اللوحة الزجاجية وبلل ورق الترشيح بمخزن مؤقت للنقل. ثم استخدم ماصة لإخراج أي فقاعات.
انقع قطعتين من ورق الترشيح المقطوع مسبقا في مخزن النقل وضعهما في منتصف ورق الترشيح. قم بإزالة أي فقاعات. ثم ضع الجانب العلوي للهلام لأسفل على ورق الترشيح وضع الغشاء أعلى الجل ، مع التأكد من محاذاة شقوق الجل والغشاء.
بعد ذلك ، ضع قطعتين من ورق الترشيح المقطوع مسبقا فوق الغشاء. قم بإزالة أي فقاعات بين الطبقات. ضع غلافا بلاستيكيا حول الجل للتأكد من أن المناشف تمتص فقط المخزن المؤقت الذي يمر عبر الجل والغشاء.
ثم قم بتكديس المناشف الورقية فوق ورق الترشيح. ضع لوحا زجاجيا كبيرا الحجم فوق المناشف وضع وزنا فوق المكدس واترك الحمض النووي الريبي ينتقل من الجل إلى الغشاء طوال الليل. بعد النقل ، حافظ على رطوبة الغشاء في المخزن المؤقت 2X SSC.
اغمر ورقتين من ورق الترشيح باستخدام مخزن مؤقت 10X SSC ، ثم ضع الأوراق في الرابط المتقاطع للأشعة فوق البنفسجية. تأكد من أن الجانب الممتص من الحمض النووي الريبي متجها لأعلى ، ثم ضع الغشاء فوق ورق الترشيح. حدد وضع الارتباط المتقاطع التلقائي ، واضغط على زر البدء لبدء التشعيع.
افحص الغشاء والهلام باستخدام ماسك صور هلام الأشعة فوق البنفسجية لتأكيد نقل الحمض النووي الريبي من الجل إلى الغشاء. سد الغشاء في 5٪ من الحليب الخالي من الدسم في محلول TBST في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. احتضان الغشاء طوال الليل في محلول الأجسام المضادة m6A عند أربع درجات مئوية.
في اليوم التالي ، اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام عازلة TBST لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم باحتضان الغشاء في محلول الأجسام المضادة للحمار المترافق HRP لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعة واحدة ، اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام عازلة TBST لمدة 15 دقيقة.
تطبيق الركيزة التلألؤ الكيميائي المحسنة. التقط التلألؤ الكيميائي باستخدام جهاز تصوير رقمي. أخيرا ، انتقل إلى القياس الكمي m6A وقم بقياس كثافة m6A الكيميائية النسبية باستخدام صورة J.Mouse تم أخذ عينات من الحمض النووي الريبي للكبد J.Mouse على فترات أربع ساعات وتمت دراستها باستخدام تقنية النشاف الشمالي المعدلة.
تم الكشف بوضوح عن مثيلة الرنا المرسال والحمض النووي الريبي المرسال والحمض النووي الريبي الصغير. تم إجراء بقع m6A التمثيلية لإجمالي الحمض النووي الريبي وبدون الحمض النووي الريبي من كبد الفئران البرية. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في أربعة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.
بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم التخلق الحمض النووي الريبي لاستكشاف التأثيرات على فسيولوجيا الإنسان المتعلقة بإيقاع الساعة البيولوجية والسمنة.
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طريقة معدلة للكشف عن تعديلات N6-methyladenosine (m6A) في الحمض النووي الريبي. تتيح هذه التقنية الكشف عن التعديلات في عينات الحمض النووي الريبي المتنوعة ويمكن تطبيقها في تصاميم تجريبية مختلفة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- إبيجيناتيكا الحمض النووي الريبي
- تعديلات m6A
- تقنيات تجريبية
الخلفية
- N6-methyladenosine هو تعديل مهم للحمض النووي الريبي.
- فهم تعديلات الحمض النووي الريبي ضروري للحصول على رؤى في تنظيم الجينات.
- الطرق الحالية لاكتشاف m6A محدودة.
- تهدف هذه التقنية المعدلة إلى تحسين الكشف والتحليل.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة موثوقة لكشف تعديلات m6A في الحمض النووي الريبي.
- تعزيز فهم إبيجيناتيكا الحمض النووي الريبي.
- توفير نهج موحد لمختلف التصاميم التجريبية.
الطرق المستخدمة
- عزل الحمض النووي الريبي من أنسجة الفئران.
- الرحلان الكهربائي لتقييم جودة الحمض النووي الريبي.
- نقل الحمض النووي الريبي إلى غشاء من النايلون.
- الكشف باستخدام أجسام مضادة لـ m6A والكيمياء الحيوية الضوئية.
النتائج الرئيسية
- الكشف الناجح عن تعديلات m6A في الحمض النووي الريبي الريبوزومي، والحمض النووي الريبي الرسول، والحمض النووي الريبي الصغير.
- توضيح واضح لتعديلات m6A في عينات مختلفة من الحمض النووي الريبي.
- يمكن تنفيذ التقنية بكفاءة في غضون أربعة أيام.
الاستنتاجات
- تقنية Northern blotting المعدلة فعالة لدراسة تعديلات الحمض النووي الريبي.
- تفتح هذه الطريقة مجلات للبحوث في إبيجيناتيكا الحمض النووي الريبي.
- تشمل التطبيقات المحتملة دراسات النظم اليومية والسمنة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Accurate measurement of RNA N6-methyladenosine (m6A) modifications supports target validation in RNA epigenetics by enabling quantitative assessment of epitranscriptomic regulation. This method enhances predictive confidence in mechanistic studies linking m6A to physiological processes such as circadian rhythms and metabolism. It provides a standardized, reproducible platform for de-risking therapeutic hypotheses in discovery biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of m6A-dependent RNA stability, translation, and splicing to clarify functional roles of epigenetic regulators in gene expression networks.
- Operational Value: Provides clear delineation of m6A across RNA species, supporting biomarker-relevant target identification in disease models.
- Predictive Value: Facilitates dose-response and time-course analysis of m6A levels, improving confidence in target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative chemiluminescent readouts compatible with high-resolution imaging for comparative analysis across experimental conditions.
- Operational Value: Standardizes RNA transfer and detection via nylon membrane and antibody-based probing, reducing variability in modification profiling.
- Assay Readiness: Enables side-by-side comparison of modified and unmodified RNA controls, supporting assay validation for epigenetic screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links m6A dynamics in liver RNA to metabolic and circadian phenotypes, supporting translational biomarker exploration in preclinical models.
- Operational Value: Permits longitudinal sampling (e.g., four-hour intervals) to capture temporal modification patterns relevant to physiological rhythms.
- Risk Mitigation: Reduces ambiguity in RNA modification measurements, improving reproducibility in target validation workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology to lead identification continuum by providing epigenetic layer validation that complements transcriptional and proteomic profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of m6A writers, erasers, and readers through direct measurement of modification status in RNA.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs for assessing compound effects on epitranscriptomic marks in cell-based or tissue-derived systems.
- Analytics: Enables image-based quantification of m6A signal intensity, facilitating statistical comparison across treatment groups or genetic backgrounds.
- Translational Research: Connects epigenetic changes in RNA to physiological outcomes, supporting biomarker-aligned preclinical progression.
- Enterprise Reuse: Adaptable to various RNA types and modification-specific antibodies, allowing reuse across multiple epigenetic targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of RNA epigenetic targets through direct, modification-specific detection.
- Operational Value: Standardized workflow with defined transfer, blocking, and detection steps ensuring inter-lab reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying the functional relevance of m6A in disease-relevant pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of epigenetic targets based on quantifiable modification dynamics.
Implementation Considerations
- Expertise in RNA handling, electrophoresis, and immunoblotting techniques is required.
- Instrumentation includes UV crosslinker, digital imager, and spectrophotometer for RNA quantification.
- Standardization across teams requires consistent use of DEPC-treated solutions and controlled transfer conditions.
- Adaptation to other RNA modifications depends on availability of specific modification-recognizing antibodies.
- Practical limitations include RNA degradation risk and the need for optimization of antibody incubation and washing conditions.
