توصيف مجمعات متعدد فرعية البروتين من MXA الإنسان عن طريق عدم تغيير طبيعة بولي أكريلاميد هلام الكهربائي

الهدف العام من هذه التجربة هو تحديد عدد الوحدات الفرعية في المعقدات البروتينية المتجانسة قليلة القسيمات (homooligomeric protein complexes) في نواتج تحلل الخلايا باستخدام الفصل الكهربائي للهلام بـ بولي أكريلاميد ودوديسيل كبريتات الصوديوم غير الممسخ. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة محورية في مجال بيولوجيا الخلية، مثل الحالة قليلة القسيمات للبروتينات المشاركة في العمليات الخلوية الأساسية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تتطلب تنقية المعقدات البروتينية المتجانسة قليلة القسيمات أو استخدام معدات متخصصة وباهظة الثمن.

وبناءً على ذلك، يمكن إجراء هذه التجربة في معظم المختبرات. تستخدم هذه التجربة نوعين من الخلايا: خلايا A549 التي تعبر عن بروتين Myxovirus resistance A الداخلي، أو MxA؛ والخلايا الفيروسية التي تفرط في التعبير عن MxA.

قم بزراعة خلايا A549 والخلايا الفيروسية (virocells) في أطباق ذات ستة آبار بمعدل 2 mL من وسط النمو لكل بئر. حضن الخلايا طوال الليل في حاضنة زراعة الخلايا. وفي اليوم التالي، قم بحصد الخلايا.

اغسل كل بئر بـ 1 mL من PBS وقم بفصل الخلايا بإضافة 0.5 mL من محلول Trypsin-EDTA بتركيز 0.25% لمدة خمس دقائق تقريباً في درجة حرارة الغرفة. وبمجرد انفصال الخلايا عن الطبق، أضف 0.5 mL من وسط النمو، واخلط المزيج بعناية عن طريق السحب والضخ باستخدام الماصة. انقل الخلايا من كل بئر إلى أنبوب سعة 2 mL، وقم بترسيبها باستخدام جهاز طرد مركزي مكتبي.

أزل الطافي بعناية باستخدام الماصة دون تعريض كتلة الخلايا للاضطراب. اغسل الخلايا بإضافة 1 mL من PBS المبرد في الثلج وسحب معلق الخلايا بالماصة للأعلى وللأسفل بعناية. قم بترسيب الخلايا في جهاز طرد مركزي سطحي.

قم بإزالة السائل الطافي بعناية باستخدام الماصة دون فصل الكتلة الخلوية. أضف 200 µL من محلول التحلل (lysis buffer) المبرد بالثلج، وأعد تعليق الخلايا عن طريق السحب والضخ بالماصة، ثم ضعها على الثلج. قم بحماية المستخلص فوراً من الضوء عن طريق تغطية الأنابيب بورق القصدير، لأن مادة iodoacetamide الموجودة في محلول التحلل حساسة للضوء.

يُحضن الخليط على الثلج لمدة 30 دقيقة. ويعد استخدام iodoacetamide أمراً بالغ الأهمية لأنه يحمي مجموعة الثيول في بقايا السيستين الحرة بشكل غير عكسي عن طريق تكوين رابطة ثيوإيثر، مما يمنع التكتل الاصطناعي للبروتينات. بعد ذلك، تُزال بقايا الخلايا عن طريق الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي مكتبي مبرد مسبقاً.

أثناء عملية الطرد المركزي، قم بتحضير أعمدة الديلزة ذات حد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 10,000. ثبّت أعمدة الديلزة في عوامة وضعها في دورق يحتوي على محلول درء (بفر) ديلزة مبرد مسبقاً لموازنة الأعمدة. تجنب لمس الغشاء.

ضع محركاً مغناطيسياً في دورق، ثم انقل الدورق إلى الغرفة الباردة. وباستخدام المحرك المغناطيسي لضمان التحريك اللطيف، اترك العينة لتصل إلى حالة التوازن لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. بعد مرور 20 دقيقة، أخرج الأعمدة من محلول الديلزة وعوامة الطفو.

انقل المستخلصات المصفاة إلى أعمدة الديلزة المُحضرة باستخدام الماصة مع تجنب لمس الغشاء. ثبّت الأعمدة في عوامة طافية. ثم أعدها إلى الكأس المملوء بمحلول الديلزة المنظم، وانقل الكأس بعد ذلك إلى الغرفة الباردة.

قم بإجراء الديلزة للمحلل لمدة أربع ساعات على الأقل عند درجة حرارة 4 °C مع التقليب بعناية باستخدام محرك مغناطيسي لإزالة المستقلبات الصغيرة والأملاح التي قد تتداخل مع الفصل الكهربائي بهلام بولي أكريلاميد غير الممسخ. عند اكتمال عملية الديلزة، انقل كل عينة مديلزة إلى أنبوب سعة 1.5 mL. تخلص من الرواسب عن طريق الطرد المركزي باستخدام جهاز طرد مركزي مكتبي.

يجب إجراء الرحلان الكهربائي فوراً بعد عملية الديلزة للنواتج المتحللة لمنع تفكك المعقدات البروتينية قليلة القسيمات. املأ غرفة الهلام الداخلية والخارجية بمحلول التوصيل المبرد مسبقاً. قم بتشغيل هلام البولي أكريلاميد غير الممسخ مسبقاً باستخدام محلول التوصيل المبرد مسبقاً بتيار قدره 25 مللي أمبير لكل هلام لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية.

امزج 15 µL من المستخلص الخلوي المُحضّر مع 5 µL من منظم عينات 4X. قم بتحميل معيار بروتيني طبيعي (native protein standard) من اختيارك و 15 µL من العينة على الهلام. قم بتشغيل الهلام عند 25 mA لمدة أربع ساعات في درجة حرارة 4 °C.

عند اكتمال عملية الفصل الكهربائي للهلام البولي أكريلاميد غير الممسوخ، قم بتفكيك الهلام ونقله بعناية إلى محلول SDS المنظم. يتم التحضين لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الرج اللطيف. قم بتجهيز إسفنجتين، وأربع ورقات ترشيح من السليلوز، وغشاء لطخ واحد لكل هلام، ونقعهم في محلول اللطخ المنظم.

قم بتجميع "الساندوتش" (الطبقات) على النحو التالي من الأسفل إلى الأعلى: إسفنجة واحدة، وورقتان من ورق ترشيح السليلوز، وغشاء لطخة، والجل، وورقتان من ورق ترشيح السليلوز، وإسفنجة واحدة. ضع هذا الترتيب الطبقي في حوض اللطخة، مع التأكد من أن الغشاء يواجه القطب الموجب، بينما يواجه الجل القطب السالب.

املأ خزان البقع بـ blotting buffer مبرد مسبقاً. وللحصول على أفضل نتائج لنقل البروتين، قم بإجراء عملية البقع عند 90 milliamps طوال الليل في درجة حرارة أربع درجات مئوية. وفي اليوم التالي، قم بتفكيك الساندوتش.

قم بتحضين الغشاء في محلول Ponceau S لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتصوير معيار البروتين. قم بإزالة الصبغة من الغشاء عن طريق وضعه في ماء منزوع الأيونات وغسله. بعد نقل الغشاء إلى صينية، قم بتحديد حزم معيار البروتين باستخدام قلم.

قم بحجب الغشاء باستخدام محلول الحجب لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل في درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، يتم تصوير البروتينات المستهدفة عن طريق التلوين المناعي باستخدام جسم مضاد متعدد النسائل من الأرانب موجه ضد MxA كما هو موضح في البروتوكول النصي. تم تحويل الخلايا الفيروسية التي تفتقر إلى MxA الداخلي باستخدام MxA البري المؤتلف ومتغيرات MxA أحادية القسيمة وثنائية القسيمة.

أكد هجرة متغيرات MxA المؤتلفة عند وزنها الجزيئي المتوقع حالتها الأوليغومرية. وقد هاجر MxA من النوع البري الذي تم التعبير عنه خارجيًا كرباعي القسيمات (tetramer). ثم استُخدمت هذه البروتينات المؤتلفة لتقييم الحالة الأوليغومرية لبروتين MxA البشري الداخلي المشتق من خلايا A549 المحفزة بإنترفيرون-ألفا.

كشفت النتيجة أن حجم MxA في نواتج تحلل خلايا A549 المحفزة بإنترفيرون-ألفا يتوافق مع رباعي القسيمات (tetramer). وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون يوم ونصف إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر عدم تجميد العينات وإذابتها طوال فترة التجربة، لأن ذلك قد يؤدي إلى تدمير التفاعلات البروتينية أو التسبب في تكتل البروتينات.

بالإضافة إلى ذلك، عند التعامل مع الكواشف الحساسة للضوء، مثل iodoacetamide، من المهم حماية العينات من الضوء أثناء خطوة التحلل. وبعد إجراء SDS-PAGE غير المسخ، يمكن تطبيق طرق أخرى مثل استخلاص البروتين من الهلام وقياس نشاط إنزيم AsiS أو إجراء PAGE ثنائي الأبعاد للإجابة على تساؤلات إضافية مثل النشاط الإنزيمي وتوصيف المعقدات غير المتجانسة قليلة القسيمات المحتملة. وقد مهدت هذه التقنية بعد تطويرها الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلية لاستكشاف تركيب المعقدات البروتينية قليلة القسيمات في الخلايا المستزرعة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير مستخلصات خلوية من المزارع الخلوية لدراسة البروتينات قليلة القسيمات (oligomeric proteins) في تحليل PAGE غير المسخ. لا تنسَ أن العمل مع iodoacetamide يمكن أن يكون خطيرًا للغاية، لذا يجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل ارتداء القفازات ووسائل حماية العين.