توصيف مجمعات متعدد فرعية البروتين من MXA الإنسان عن طريق عدم تغيير طبيعة بولي أكريلاميد هلام الكهربائي
October 28th, 2016
تصف هذه المقالة بروتوكولا بسيطا وسريعا لتقييم حالة قلة القلة لبروتين GTPase MxA الشبيه بالدينامين من محللات الخلايا البشرية باستخدام مزيج من PAGE غير المتمسخ مع تحليل اللطخة الغربية.
الهدف العام من هذه التجربة هو تحديد عدد الوحدات الفرعية في مجمعات البروتين المتماثل في محللات الخلايا باستخدام الرحلان الكهربائي لجل دوديكوسلفات الصوديوم وبولي أكريلاميد غير المتمسخ. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلية ، مثل حالة القلة للبروتينات المشاركة في العمليات الخلوية الأساسية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تتطلب تنقية مجمعات البروتين المتماثلة أو المعدات المتخصصة باهظة الثمن.
لذلك ، يمكن إجراؤه في معظم المختبرات. تستخدم هذه التجربة نوعين من الخلايا. خلايا A549 التي تعبر عن مقاومة الفيروس المخاطي الداخلي بروتين A ، أو MxA ؛ والخلايا الفيروسية التي تفرط في التعبير عن MxA.
قم بزرع خلايا A549 والخلايا الفيروسية في ستة أطباق بئر مع ملليلترين من وسط النمو لكل بئر. احتضان الخلايا طوال الليل في حاضنة زراعة الخلايا. في اليوم التالي ، حصاد الخلايا.
اغسل كل بئر بمليلتر واحد من PBS وقم بإرفاق الخلايا بإضافة 0.5 مل من محلول Trypsin-EDTA بنسبة 0.25٪ لمدة خمس دقائق تقريبا في درجة حرارة الغرفة. بمجرد أن تنفصل الخلايا عن الطبق ، أضف 0.5 مل من وسط النمو ، واخلطها بعناية عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. انقل خلايا كل بئر إلى أنبوب سعة ملليلتر ، وقم بتكبيرها باستخدام جهاز طرد مركزي أعلى الطاولة.
قم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق سحب العينة دون إزعاج حبيبات الخلية. اغسل الخلايا عن طريق إضافة ملليلتر واحد من PBS المثلج وسحب تعليق الخلية بعناية لأعلى ولأسفل. بيليه الخلايا في جهاز طرد مركزي أعلى الطاولة.
قم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق سحب العينة دون فصل حبيبات الخلية. أضف 200 ميكرولتر من محلول التحلل المثلج ، وأعد تعليق الخلايا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ، ثم ضعها على الثلج. قم بحماية المحللة على الفور من الضوء عن طريق تغطية الأنابيب بورق القصدير لأن اليودوأسيتاميد الموجود في عازلة التحلل حساس للضوء.
احتضن على الثلج لمدة 30 دقيقة. يعد استخدام اليودوأسيتاميد أمرا بالغ الأهمية لأن اليودوأسيتاميد يحمي بشكل لا رجعة فيه مجموعة الثيول من السيستين الحر عن طريق تكوين رابطة ثيويثير ويمنع تراكم البروتين الاصطناعي. بعد ذلك ، قم بإزالة حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا على سطح الطاولة.
أثناء الطرد المركزي ، قم بإعداد أعمدة غسيل الكلى بقطع الوزن الجزيئي 10،000. قم بتوصيل أعمدة غسيل الكلى بعوامة عائمة وضعها في دورق مملوء بمخزن غسيل الكلى المبرد مسبقا لموازنة الأعمدة. لا تلمس الغشاء.
ضع أداة النمام المغناطيسية في دورق وانقل الدورق إلى الغرفة الباردة. باستخدام أداة النمام المغناطيسية لضمان التحريك اللطيف ، قم بالتوازن لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد 20 دقيقة ، قم بإزالة الأعمدة من مخزن غسيل الكلى والعوامة العائمة.
انقل المحللات التي تم تطهيرها إلى أعمدة غسيل الكلى المعدة عن طريق سحب العينة دون لمس الغشاء. نعلق الأعمدة على عوامة عائمة. ضعهم مرة أخرى في الدورق المملوء بمحلول غسيل الكلى ، ثم انقل الدورق إلى الغرفة الباردة.
غسيل الكلى للمحللة لمدة أربع ساعات على الأقل عند أربع درجات مئوية مع التقليب بعناية باستخدام محرك مغناطيسي لإزالة المستقلبات الصغيرة والأملاح التي يمكن أن تتداخل مع الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد غير المتمسخ. عند اكتمال غسيل الكلى ، انقل كل عينة محللة إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. إزالة الرواسب عن طريق الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي على الطاولة.
يجب إجراء الرحلان الكهربائي مباشرة بعد غسيل الكلى للمحللات لمنع تفكك مجمعات البروتين قليل القلة. املأ حجرة الجل الداخلية والخارجية بمخزن مؤقت مبرد مسبقا. قم بتشغيل جل بولي أكريلاميد غير المتغيرة مسبقا مع مخزن مؤقت مبرد مسبقا عند 25 مللي أمبير لكل هلام لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
امزج 15 ميكرولترا من المحللة المحضرة مع خمسة ميكرولترات من المخزن المؤقت للعينة 4X. قم بتحميل معيار البروتين الأصلي المفضل و 15 ميكرولترا من العينة على الجل. قم بتشغيل الجل على حرارة 25 مللي أمبير لمدة أربع ساعات عند أربع درجات مئوية.
عند اكتمال الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد غير المتغير، قم بتفكيك الجل ونقله بعناية إلى عازلة SDS. احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع رج لطيف. قم بإعداد إسفنجتين ، وأربع أوراق ترشيح السليلوز ، وغشاء نشاف لكل هلام وانقعها في محلول النشاف.
قم بتجميع الساندويتش على النحو التالي من الأسفل إلى الأعلى. إسفنجة واحدة ، ورقتان من ورق ترشيح السليلوز ، غشاء نشاف ، هلام ، ورقتان من ورق ترشيح السليلوز ، وإسفنجة واحدة. ضع الساندويتش في خزان النشاف ، وتأكد من أن الغشاء يواجه عمود الجمع ، بينما يواجه الجل قطب الناقص.
املأ خزان النشاف بمحلول نشاف مبرد مسبقا. للحصول على أفضل نتائج نقل البروتين ، امسح 90 مللي أمبير بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بتفكيك الساندويتش.
احتضان الغشاء في محلول Ponceau S لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتصور معيار البروتين. قم بإزالة الغشاء عن طريق وضعه في ماء منزوع الأيونات وغسله. بعد نقل الغشاء إلى صينية ، ضع علامة على أشرطة معيار البروتين باستخدام قلم.
سد الغشاء بمحلول مانع لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، يتم تصور البروتينات ذات الأهمية عن طريق التلوين المناعي باستخدام جسم مضاد متعدد النسيلة للأرانب موجه ضد MxA كما هو موضح في بروتوكول النص. تم نقل الخلايا الفيروسية التي تفتقر إلى MxA الداخلي مع النوع البري المؤتلف MxA والتباين الأحادي والثنائي MxA.
أكدت هجرة تباين MxA المؤتلف عند وزنها الجزيئي المتوقع حالتها قليلة القلة. هاجر النوع البري المعبر عنه خارج الرحم MxA كرباعي. ثم تم استخدام هذه البروتينات المؤتلفة لتقييم حالة القلة لبروتين MxA البشري الداخلي المشتق من خلايا A549 المحفزة بالإنترفيرون ألفا.
كشفت النتيجة أن حجم MxA في محللات خلايا A549 المحفزة بالإنترفيرون ألفا يتوافق مع رباعي. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في يوم ونصف إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر عدم تجميد العينات وإذابتها أثناء الإجراء بأكمله ، لأن هذا قد يدمر تفاعلات البروتين أو يتسبب في تراكم البروتين.
بالإضافة إلى ذلك ، عند العمل مع الكواشف الحساسة للضوء ، مثل اليودوأسيتاميد ، من المهم حماية العينات من الضوء أثناء خطوة التحلل. بعد SDS-PAGE غير المتناسق ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل استخراج هلام البروتين والنشاط الأنزيمي AsiS أو PAGE البعد الثاني من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل النشاط الأنزيمي وتوصيف المجمعات قليلة القلة المحتملة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلية لاستكشاف تكوين مجمعات البروتين قليل القلة في الخلايا المستزرعة.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير محللات الخلايا من مزارع الخلايا لدراسة بروتينات قلة القلة في تحليل PAGE غير المتغير. لا تنس أن العمل مع اليودوأسيتاميد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات وحماية العين.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
النظرة العامة
تصف هذه المقالة بروتوكولًا سريعًا لتقييم الحالة الأوليجوميرية لبروتين MxA باستخدام PAGE غير المفكك وتحليل Western blot. هذا الأسلوب قابل للتطبيق على المستخلصات الخلوية من الخلايا البشرية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- تحليل البروتين
- الكيمياء الحيوية
الخلفية
- فهم الحالة الأوليجوميرية للبروتينات أمر بالغ الأهمية في بيولوجيا الخلية.
- مجمعات البروتين المتجانسة تلعب أدوارًا هامة في العمليات الخلوية.
- غالبًا ما تتطلب الطرق التقليدية تنقية البروتين، مما قد يكون مرهقًا.
- يسمح هذا البروتوكول بالتحليل مباشرة من المستخلصات الخلوية.
غرض الدراسة
- لتحديد عدد الوحدات الفرعية في مجمعات البروتين المتجانسة.
- لتقييم الحالة الأوليجوميرية لبروتين MxA في أنواع خلوية مختلفة.
- لتوفير طريقة بسيطة يمكن الوصول إليها في معظم المختبرات.
الطرق المستخدمة
- الرحلان الكهربائي غير المفكك لكبريتات الصوديوم دولدسليل-بولي أكريلاميد (PAGE).
- تحليل Western blot للكشف عن البروتين.
- استخدام خلايا A549 والخلايا الفيروسية لتحليل تعبير MxA.
- تحليل المستخلصات الخلوية دون الحاجة إلى تنقية.
النتائج الرئيسية
- تقييم ناجح للحالة الأوليجوميرية لـ MxA من المستخلصات الخلوية.
- أظهر جدوى الأسلوب في إعدادات المختبر القياسية.
- قدم رؤى حول دور البروتين في العمليات الخلوية.
- سلط الضوء على مزايا تقنيات عدم التنقية.
الاستنتاجات
- البروتوكول فعال لتحليل أوليجوميرية البروتين.
- يمكن استخدامه في سياقات بحثية مختلفة ضمن بيولوجيا الخلية.
- يعزز هذه الطريقة من إمكانية الوصول للباحثين الذين يدرسون مجمعات البروتين.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Assessing the oligomeric state of antiviral proteins like MxA directly from cell lysates enables mechanistic de-risking of target hypotheses in early discovery. This non-denaturing PAGE approach supports target validation by linking functional oligomeric forms to antiviral activity without requiring protein purification. The method provides a scalable, reproducible readout for evaluating mutant phenotypes in a disease-relevant system, informing lead identification and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating MxA oligomeric states with antiviral function.
- Operational Value: Enables functional target validation using endogenous or ectopic expression in human cell lines.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by distinguishing active oligomeric complexes from inactive monomers or aggregates.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares standardized lysates for downstream screening of MxA modulators or interface mutants.
- Quantitative Output: Generates resolvable oligomeric bands (monomer, dimer, tetramer) for comparative analysis across conditions.
- Reproducibility: Uses dialysis and light-protected lysis to minimize artifactual aggregation, ensuring consistent complex detection.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Evaluates MxA oligomerization in interferon-stimulated A549 cells, a physiologically relevant model of antiviral response.
- Translational Continuity: Links oligomeric state to antiviral phenotype, supporting biomarker-aligned target assessment.
- Preclinical De-risking: Enables structure-function analysis of MxA mutants to guide therapeutic candidate selection.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, enabling oligomerization assessment after target engagement but before lead optimization, particularly for GTPase-mediated antiviral targets.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about oligomerization-dependent activity without perturbing native complexes.
- Screening: Delivers quantitative electrophoretic readouts to compare wild-type and mutant protein assemblies.
- Analytics: Provides subunit resolution via native PAGE, enabling densitometric comparison of oligomeric populations.
- Translational Research: Connects biochemical state to antiviral function in human cells, supporting target confidence.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other dynamin-like GTPases or oligomeric signaling proteins in antiviral or innate immunity pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by defining the active oligomeric state of MxA.
- Operational Value: Employs standard lab equipment (centrifuge, gel apparatus, blotter) avoiding specialized infrastructure.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by validating whether observed antiviral effects correlate with defined oligomeric species.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of MxA-targeted strategies based on oligomerization competence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in native PAGE, dialysis, and western blotting to preserve labile complexes.
- Needs pre-chilled buffers, magnetic stirrer, dialysis columns (10 kDa cutoff), and light-protected handling of iodoacetamide.
- Demands standardized lysis and dialysis protocols across teams to prevent variability in oligomer detection.
- Must avoid freeze-thaw cycles and protease activity to maintain complex integrity during sample prep.
- Limited to detecting stable oligomers; transient or weak interactions may require crosslinking or orthogonal validation.
