الآلي الجمعية معالجة السائل الروبوتية أجهزة وحدات الحمض النووي

الهدف العام لبروتوكول تجميع الحمض النووي هذا هو تمكين الإنتاج الآلي القابل للتكرار والقابل للتطوير وعالي الإنتاجية لأجهزة الحمض النووي. يعالج هذا العمل الحاجة إلى سير عمل برامج قوي وسهل الاستخدام يمكنه إنشاء تعليمات سحب للمعالج للسوائل بناء على تصميمات أجهزة DNA عالية المستوى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن تحضير التفاعل الآلي قابل للتكرار وقابل للتطوير ويتطلب أقل من 4٪ من وقت التدريب العملي مقارنة بالتحضير اليدوي.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن خطوات الأتمتة قد يكون من الصعب تعلمها ، وهي مزيج من الأساليب التجريبية والحسابية. تم تطوير أداة برمجية يمكنها أتمتة إنشاء البرامج النصية لهذه الدراسة. باستخدام أي متصفح ويب ، انتقل إلى MoCloAssembly.

com وتحميل ملفات GenBank لجميع أجزاء الحمض النووي التي سيتم تضمينها في تصميم جهاز الحمض النووي التوافقي. بمجرد تحميل جميع الملفات ، حدد أجزاء الحمض النووي المطلوبة. يمكن اختيار مجموعات من الأجزاء وكذلك الأجزاء الفردية.

اسحب الأجزاء إلى اللوحة القماشية الفارغة. اطلب أجزاء الحمض النووي بحيث تتطابق الأجزاء المتدلية الخمسة الأولية والثلاثة الأولية لكل جزء. ضع أنواع الأجزاء بالترتيب النهائي المقصود لأجزاء الحمض النووي.

انقر فوق تجميع في أسفل يسار الصفحة. لاحظ أن أداة البرنامج ستقوم فقط بإنشاء تجميعات صالحة قابلة للبناء بناء بناء على الأجزاء المتدلية الأربعة لأزواج القواعد التي تحيط بكل جزء عند الهضم باستخدام إنزيم BSA1. انتقل إلى علامة التبويب الخطط وقم بتنزيل الملفات التي تم إنشاؤها بواسطة الأداة.

ستتضمن هذه الملفات خرائط لوحة يمكن قراءتها من قبل العلماء لإعداد عينات الحمض النووي بالإضافة إلى الكواشف اللازمة للتفاعلات ، وقائمة اختيار لمعالج السوائل وملفات GenBank المشروحة بالكامل لجميع أجهزة الحمض النووي التي سيتم تجميعها. قبل البدء في تجميع الحمض النووي المعياري ، قم بإعداد الحمض النووي البلازميد كما هو موضح في بروتوكول النص. الخطوة الوحيدة الأكثر أهمية في هذا الإجراء هي المحتوى الصحيح للوحة الإعداد ولوحة الكاشف باستخدام خرائط اللوحة التي تم إنشاؤها بواسطة الأداة.

باتباع خريطة اللوحة لملف PDF الذي تم إنشاؤه بواسطة أداة التجميع ، ضع الحجم المشار إليه لكل جزء من الحمض النووي المخفف في البئر المناسب على لوحة PCR كاملة التحولين 96 بئر. امسك لوحة الإعداد هذه على الثلج لحين الحاجة. على الجليد ، قم بإعداد مزيج التفاعل الرئيسي مع المكونات التالية.

لكل 20 ميكرولتر من التفاعل ، أضف ميكرولترين من 0X T4 DNA ligase buffer ، و 0.5 ميكرولتر من T4 DNA ligase و ميكرولتر واحد من إنزيم BSA1. باتباع خريطة اللوحة للوحة الكاشف في ملف PDF الذي تم إنشاؤه ، قم بتوزيع مزيج الإنزيم الرئيسي في الآبار المناسبة للوحة PCR جديدة ذات حواف كاملة 96 بئرا. احتفظ بلوحة الكاشف هذه على الجليد أو على كتلة باردة مكونة من 96 بئرا.

لبدء هذا الإجراء ، ضع لوحة الإعداد ولوحة الكاشف على سطح معالج السائل. قم بتضمين لوحة PCR فارغة كاملة التنورة سعة 96 بئرا. ستكون اللوحة الفارغة هي لوحة الإخراج حيث يتم تجميع التفاعلات.

قم بإعداد برنامج التحكم في معالج السوائل عن طريق إنشاء مثيلات لكل عينة ولوحة كاشف معدة مع التأكد من تسميتها تماما كما تظهر على خرائط اللوحة التي تم إنشاؤها بواسطة MoCloAssembly. com بما في ذلك حوض من المياه النظيفة منزوعة الأيونات المسمى خزان. باستخدام الأمر Worklist في برنامج التحكم ، قم بتحميل ملف GWL الذي تم إنشاؤه بواسطة أداة البرنامج الخاصة بنا متبوعا بأمر Worklist آخر والذي سينفذ ملف GWL الذي تم تحميله في الأمر الأول.

قم بتنفيذ البرنامج النصي باستخدام الأمر Run الخاص ببرنامج وحدة التحكم. بعد أن يكمل معالج السائل الآلي تنفيذ البرنامج النصي ، قم بإزالة جميع الألواح من سطح معالج السائل. احفظ الحمض النووي المتبقي عن طريق إغلاق لوحة الإعداد بغشاء مانع للتسرب من الألومنيوم وتخزينه عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.

أغلق لوحة الإخراج بغشاء لاصق ، وضعها في جهاز تدوير حراري أو كتلة حرارية وقم بتشغيلها باستخدام معلمات الدورة التالية. 37 درجة مئوية لمدة ساعتين ، 50 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق واستمر عند أربع درجات مئوية. للحفاظ على العقم ، يجب تنفيذ هذا الإجراء بالقرب من اللهب المكشوف.

قم بإذابة العدد المطلوب من حصات الخلايا الإشريكية القولونية المختصة اللازمة على الثلج. أثناء ذوبان الخلايا ، قم بإعداد ألواح أجار LB التي تحتوي على المضاد الحيوي المناسب. اصنع مزيجا رئيسيا يحتوي على IPTG و X-GAL.

ماصة 100 ميكرولتر من المزيج الرئيسي على سطح كل لوحة ، واستخدم الخرز الزجاجي لطلاء اللوحة بالتساوي. احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل طلاء البكتيريا. قم بإعداد لوحة التحويل عن طريق نقل 10 ميكرولتر من الخلايا المختصة لكل تفاعل في لوحة PCR جديدة مكونة من 96 بئرا على الجليد.

أضف واحدا إلى ثلاثة ميكرولتر من كل تفاعل من لوحة الإخراج إلى البئر المقابل في لوحة التحويل واحتضنه على الجليد لمدة خمس دقائق. أغلق لوحة التحويل بغشاء لاصق وصدمة حرارية في جهاز تدوير حراري عند 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. ضع الطبق على الفور على الثلج لمدة دقيقتين.

إلى نفس آبار لوحة التحويل ، أضف 150 ميكرولترا من وسائط SOC ، وأغلقها بختم لاصق ، واحتضن عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 900 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة. بعد ساعة واحدة ، قم بلوحة المحتوى الكامل لكل بئر من لوحة التحويل على ألواح أجار LB المعدة مسبقا. استخدم حبات زجاجية لطلاء سطح اللوحة بالتساوي.

احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي للتحول ، قم بإعداد واحد أو أكثر من كتل ثقافة البئر العميقة المكونة من 96 بئرا مع 1.5 مل من مرق LB لكل بئر. باستخدام عود أسنان معقم ، والعمل بالقرب من لهب مكشوف ، اختر مستعمرات بيضاء مفردة من كل صفيحة أجار LB من التفاعلات المحولة وتلقيح كتلة ثقافة البئر العميقة.

أغلق كتلة الثقافة بختم نفاذية للغاز واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 900 دورة في الدقيقة طوال الليل. بعد ذلك ، قم بعزل الحمض النووي للبلازما من مزارع البكتيريا باستخدام أي مجموعة متاحة تجاريا ، وقم بتقديمه لتسلسل Sanger للتحقق من المستنسخة. تمت مقارنة أوقات تجميع التفاعل عبر جميع الطرائق الثلاث.

استغرق التجميع اليدوي ساعتين و 10 دقائق ، وكلها كانت وقتا عمليا. استغرق معالج السوائل قدرا مماثلا من الوقت لتنفيذ أوامر سحب العينات ، ولكن خمس دقائق فقط من ذلك الوقت كانت عملية. استغرق الموزع الصوتي وقتا أقل بكثير لتنفيذ عمليات نقل السوائل ، وبأقل وقت عملي.

يوضح هذا الرسم البياني تكلفة التفاعل لكل طريقة تجميع. تشمل هذه التكلفة سعر الإنزيمات وأطراف الماصات المستخدمة. تم الحصول على التسلسلات الصحيحة ل 95٪ من مجموعات المناولة اليدوية والسائلة البالغ عددها 96.

تم تحويل 12 فقط من المجموعات البالغ عددها 96 مجموعة من العينات المحضرة للموزع الصوتي وكانت 83٪ صحيحة. فشل تفاعلان في إنتاج أي مستعمرات بيضاء على الأرجح بسبب عدم كفاية الخلط بين قطرات مزيج الحمض النووي والإنزيم الرئيسي في لوحة الإخراج. تظهر مقارنة كفاءات تفاعل الاستنساخ المقاسة بنسبة المستعمرات البيضاء إلى العدد الإجمالي للمستعمرات نسب مماثلة للتفاعلات المجمعة يدويا ومعالجة السائل.

باستخدام أداتنا ، يمكن للباحثين الاستفادة من روبوتات مناولة السوائل لبناء مكتبات الحمض النووي الاندماجية. هذه الطريقة قابلة للتكرار وقابلة للتطوير وتوفر وقت الباحث الثمين وتقلل من احتمالية حدوث أخطاء في سحب العينات التي تنشأ عن أداء البشر لمهام سحب العينات المعقدة المتكررة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تعرف كيفية إنشاء تجميعات اندماجية لتفاعلات الاستنساخ المعيارية باستخدام أداتنا عبر الإنترنت ، وكيفية تنفيذ نصين نصيين لسحب العينات تم إنشاؤهما على روبوت معالجة السوائل.

نحن نتصور تجميع الحمض النووي الآلي باستخدام روبوتات مناولة السوائل كخطوة واحدة فقط في مختبرات البيولوجيا التركيبية المستقبلية. مع زيادة تعقيد التصميم ، نتوقع أن تكون مثل هذه الأساليب منتشرة بشكل متزايد ونحن متحمسون لتمثيل هذه الخطوة الأولى في هذه العملية.