نموذج الفئران من المجموعة الثانية العقدية المهبلية الاستعمار

الهدف العام من هذا النموذج الحيواني هو إنشاء المجموعة B Streptococcus ، أو استعمار GBS للجهاز المهبلي الفئراني. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في فهم الأسئلة الرئيسية حول استعمار المكورات العقدية من المجموعة ب ، مثل ، ما هي العوامل البكتيرية المهمة للاستعمار ، وكذلك كيف تؤثر استجابات المضيف على ثبات المهبل. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن التلقيح ، عادة ، يؤدي إلى استعمار أكثر من 90 في المائة دون استخدام التخدير أو مثبطات المناعة أو عوامل التكثيف.

ابدأ بدوامة 0.5 ملليغرام من بيتا استراديول ، لكل فأر ، في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر حتى تتم إزالة جميع الكتل ويظهر بيتا استراديول كمسحوق ناعم. بعد ذلك ، تقوم المحقنة بتصفية 100 ميكرولتر من زيت السمسم ، لكل فأر ، في الأنبوب من خلال مصفاة 0.45 ميكرون ، ودوامة الأنبوب مرة أخرى. عندما يتم توزيع الهرمون كتعليق متجانس في جميع أنحاء الزيت ، ارسم الكاشف في حقنة جديدة سعة 10 مليلتر وقم بإرفاق إبرة قياس 18 بوصة واحدة.

Aliquot 100 ميكرولتر من التعليق في واحدة ، حقنة توبركولين واحدة ، لكل فأر ، وتجهيز كل حقنة توبركولين بإبرة معقمة ، قياس 26 ، نصف بوصة. بعد ذلك ، قم بتوصيل 100 ميكرولتر من بيتا استراديول في الربع السفلي الأيسر أو الأيمن من التجويف البريتوني لكل. في نفس يوم الحقن ، قم بزراعة خمسة ملليلتر ، مزرعة سائلة بين عشية وضحاها لسلالة GBS ذات الأهمية في مرق تود هيويت ، أو THB ، عند 37 درجة مئوية.

في صباح اليوم التالي ، استزراع GBS بحجم واحد إلى 10 في THB الطازج لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية ، حتى تصل البكتيريا إلى مرحلة منتصف السجل. بعد ذلك ، قم بنقل المزرعة الفرعية إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مليلتر ، وقم بالطرد المركزي للخلايا البكتيرية. أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من PBS المعقم.

بعد ذلك ، قم برفع الحجم الإجمالي للتعليق إلى مليلتر واحد من PBS لكل 10 فئران ، للوصول إلى OD600 من 0.4 في أنبوب ثقافة جديد سعة خمسة ملليلتر. انقل المزرعة إلى أنبوب جديد سعة 15 مليلتر وأعد تكبيبات البكتيريا. بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا في PBS بعشر الحجم الأصلي.

احتفظ ب 50 ميكرولترا من البكتيريا للتخفيف التسلسلي والطلاء على أجار THB ، لتحديد CFU الدقيق لللقاح. بعد ذلك ، اسحب 10 ميكرولترات من GBS في طرف ماصة محملة بالهلام سعة 200 ميكرولتر ، وقم بتأمين الجلد المترهل يدويا عند قفص الرقبة ، للحيوان الأول ، بين الإبهام والسبابة ، متبوعا بتثبيت الذيل. أدخل طرف الماصة من 5 إلى 10 ملليمترات في تجويف المهبل، وقم بتوزيع الحجم الكامل لللقاح.

بعد ذلك ، حرر القفص على الفور وارفع الذيل لرفع الطرف الخلفي للحيوان ، أثناء المشي على الكفوف الأمامية على سطح صلب. بعد دقيقة ، افحص فتحة المهبل بصريا بحثا عن أي تدفق ارتجاعي للتلقيح. قبل المسح مباشرة ، قم بترطيب القطن مسبقا في PBS ، وكبح جماح أحد الفئران كما هو موضح للتو.

أدخل المسحة 10 ملليمترات في تجويف المهبل ، وقم بتدويرها برفق أربع مرات في اتجاه عقارب الساعة ، وأربع مرات عكس اتجاه عقارب الساعة ، مع الضغط قليلا على جدار المهبل. ضع المسحة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 100 ميكرولتر من PBS ، وقم بتدوير الأنبوب والمسحة لمدة 15 ثانية تقريبا لتحرير البكتيريا من ألياف القطن. بعد ذلك ، قم بتخفيف كل عينة بشكل متسلسل في PBS ، ولوحة 20 ميكرولتر من واحد إلى 10 من خلال واحد إلى 10 ، 000 مخفف على لوحة أجار متوسطة تفاضلية ، معدة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، للحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

ستظهر مستعمرات GBS إما باللون الوردي الفاتح أو البنفسجي. لتجميع غسل المهبل، استخدمي طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر محملة بالهلام لتوزيع 20 ميكرولتر من PBS في تجويف المهبل. قم بتحريك مستوى الصوت بالكامل برفق لأعلى ولأسفل أربع مرات داخل التجويف.

ثم ، باستخدام نفس النصيحة ، اسحب الحجم بالكامل. لتحليل سائل الغسيل في اتجاه مجرى النهر ، قم بتوزيع الغسيل في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.7 ملليلتر. لتشريح الأنسجة ، قم برش البطن البطني لحيوان قتل رحيم بنسبة 70 في المائة من الإيثانول ، واستخدم مقصا معقما لفتح تجويف البطن

إزاحة الأمعاء بحيث ينكشف الجهاز التناسلي. ثم ، قم بقطع قرني الرحم ، متوسط الطول ، بين جسم الرحم والمبايض. باستخدام المقص والملقط ، افصل الدهون الحشوية والأغشية والمثانة البولية عن الجهاز التناسلي ، وحرك الأنسجة ذيليا.

ثم قم بقطع المهبل بشكل عرضي بالقرب من الفرج قدر الإمكان ، لفصل الجهاز التناسلي عن الجسم. انقل الجهاز التناسلي إلى طبق بتري معقم ، واستخدم شفرة حلاقة جديدة لفصل الرحم عن عنق الرحم في قطع عرضي واحد. افصل عنق الرحم عن المهبل بقطع عرضي آخر.

بعد ذلك ، استخدم ملقطا معقما لنقل كل من الأنسجة إلى أنبوبين فرديين ، موزون مسبقا ، مليلتر يحتويان على 500 ميكرولتر من PBS وخرز متجانس. وزن كل أنبوب 2 مليلتر لتحديد أوزان الأنسجة. بعد ذلك ، أغلق أنابيب الغطاء اللولبي بإحكام وقم بتجانس الأنسجة ، لمدة دقيقة واحدة ، بأقصى سرعة ، في خالط الأنسجة.

لتحديد الحمل البكتيري ، قم بتخفيف 25 ميكرولترا من الأنسجة المتجانسة بشكل متسلسل والصفيحة من واحد إلى 10 إلى 10،000 مخفف على ألواح أجار متوسطة تفاضلية ، لمدة 24 ساعة ، عند 37 درجة مئوية. لتخزين عينات لقياس كمية السيتوكين ، قم بتجميد المتجانسات عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. في هذه الصور ، يتم توضيح المراحل الأربع لدورة شبق الفأر ، كما هو محدد بواسطة سائل غسل المهبل الرطب.

تم استعمار الفئران التي تم تلقيحها في مرحلة الشبق ب GBS لفترة أطول من أي مرحلة أخرى من الشبق ، خاصة تلك الموجودة في الديستروس في وقت التلقيح. يعزز الشبق المستمر ثبات GBS A909 في الفئران CD-1 مع استعمار بنسبة 90 في المائة لوحظ بعد أسبوعين من التطعيم. في تجربة نموذجية بجرعة واحدة من بيتا استراديول قبل التلقيح ، تم استعمار 40 إلى 50 في المائة فقط من الفئران بعد أسبوع واحد من التلقيح ، مع متوسط GBS المسترد الذي يحاكي النسبة المئوية للاستعمار.

إثبات أن الحفاظ على الشبق المستمر يعزز ثبات المهبل GBS في غالبية الفئران CD-1. يستمر GBS A909 في الجهاز المهبلي في الفئران CD-1 الفطرية والفئران الفطرية FVB لمدة أسبوع تقريبا. في حين أن غالبية الفئران الفطرية BALB / c و C57BL / 6 تصبح مستعمرة في أسبوع واحد لمدة شهر أو أكثر.

يوضح تصور GBS الإيجابي ل GFP في الملقحة وجود GBS ملتصق بظهارة مهبل الفئران وعلى مقربة من الفلورا المهبلية الأصلية الأخرى. من المهم منع التدفق العكسي ، أثناء التلقيح ، للتأكد من أن جميع الفئران تصبح مستعمرة. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون ساعة إلى ساعتين ، اعتمادا على عدد.

يسمح هذا النموذج للباحثين في مجال تفاعلات المضيف / العامل الممرض ، باستكشاف قدرة البكتيريا ، مثل البكتيريا العقدية من المجموعة ب ، على استعمار الجهاز التناسلي الأنثوي. يمكن استخدام هذا الإجراء لاختبار مركبات جديدة أو علاجات بروبيوتيك للإجابة على أسئلة إضافية حول التدخلات العلاجية.