الكشف عن المثقبية البروسية التبديل البديل البروتين السكري السطح بواسطة المغناطيسي خلية المنشط فرز والتدفق الخلوي

الهدف العام من هذه الطريقة هو عزل المثقبيات التي تعبر عن بروتين سكري سطحي متغير معين أو VSG عن بقية السكان وتحديد الطفيليات التي تحولت من VSG السائد إلى أي VSG آخر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا المثقبيات ، مثل العوامل أو الأحداث التي تؤثر على تبديل VSG في مجموعة من الطفيليات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها أسرع من الطرق المنشورة سابقا وتسمح بالقياس الكمي السهل للتبديل إلى الخلايا غير المبديلة.

عندما بدأ المختبر العمل لأول مرة على تباين المستضدات ، كانت المشكلة الأولى هي كيفية اكتشاف المحولات النادرة. تم حل هذا النوع من المشاكل بالفعل في علم المناعة منذ عدة سنوات ، من خلال استخدام فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا لإثراء الخلايا التي كانت سلبية لسمة معينة. بدا نقل عملية عدم الاختيار إلى تباين المستضد فكرة واعدة حقا.

للبدء ، يجب زراعة المثقبيات من سلالة Lister 427 إلى كثافة 0.5 إلى 100،000 لكل مليلتر. Aliquot a 50 في 10 إلى عينة الخلايا الست في أنبوب 15 مليلتر ثم جهاز الطرد المركزي. وفر مرة واحدة في 10 للخلايا الست والمزرعة لاستخدامها لاحقا كعناصر تحكم إيجابية وسلبية للأجسام المضادة.

ماصة من معظم المادة الطافية تاركة ما يقرب من 750 ميكرولترا في الأنبوب. انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. أخيرا ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند أربع درجات مئوية لمدة أربع دقائق عند 2800 مرة جرام.

ثم قم بإخراج كل المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في 150 ميكرولتر من وسط الاستزراع ، بالإضافة إلى الجسم المضاد للبروتين السكري السطحي الأولي المضاد للمتغير أو مضاد VSG عند التخفيف المناسب. بعد ذلك ، قم بدوامة الخلايا عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

يغسل ب 800 إلى 1000 ميكرولتر من وسط الاستزراع البارد. الطرد المركزي للخلايا عند أربع درجات مئوية لمدة أربع دقائق عند 5200 مرة جرام. بعد شفط المادة الطافية ، اغسل الخلايا بملليلتر واحد من وسط الثقافة وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى.

قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع. أضف 110 ميكرولترا من ميكروبيدات فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا من النوع المناسب للجسم المضاد الأساسي. تخلط جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ثم الدوامة.

أثناء دوامة الخلايا ، قم بإعداد عمود فصل منشط مغناطيسيا. ضع أنبوبا سعة 15 مليلتر تحته لتجميع وسط التحضير. أضف ملليلترين من وسط الثقافة لتجهيز العمود.

بعد ذلك ، قم بإزالة العينة من الدوامة وأضف 800 إلى 1000 ميكرولتر من وسط الثقافة الباردة. الطرد المركزي للعينة ثم إزالة المادة الطافية لإزالة الجسم المضاد غير المرتبط. اغسل الخلايا المحببة بملليلتر واحد من وسط الزراعة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.

هذه المرة استنشق المادة الطافية ولكن اترك 100 ميكرولتر في الأنبوب. انقر فوق أنبوب الطرد المركزي بقوة حتى يتم تعليق الحبيبات بالكامل. أضف ملليلترا واحدا من وسط المزرعة والماصة لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الخلايا بالكامل.

قم بإزالة الأنبوب المخروطي 15 ملم المستخدم لجمع وسط التحضير واستبدله بمخروط جديد سعة 15 مليلتر لتجميع التدفق الذي يحتوي على الطفيليات المبديلة. قم بتطبيق تعليق الخلية على العمود المعبأ. اجمع التدفق في أنبوب سعة 15 مليلتر أسفله والذي يستغرق عادة من ست إلى سبع دقائق لمليلتر واحد من المثقبيات المتوسطة بالإضافة إلى المثقبيات.

بعد ذلك ، اغسل العمود مرتين بمليلتر واحد من وسط الثقافة واجمع التدفق في نفس الأنبوب. قسم التدفق الذي يجب أن يبلغ إجماليه حوالي ثلاثة ملليلتر إلى أنبوبين من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل. ثم ضع الأنابيب على الجليد.

أضف ثلاثة ملليلتر من وسط الثقافة إلى العمود واغمر العمود في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. سيؤدي ذلك إلى الحصول على الخلايا التي تعبر عن VSG المهيمن في البداية. قم بإزالة 300 ميكرولتر من هذه المادة المملوءة واحتفظ بها على الجليد ، ويمكن التخلص من الباقي.

لإنشاء تحكم إيجابي ، خذ ما يقرب من 100،000 خلية من ثقافة البداية للخلايا وقم بماصتها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. كرر هذا لإنشاء عنصر تحكم سلبي. جهاز الطرد المركزي لعينات التدفق وعينة التحكم الإيجابية.

ثم قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها. قم بإعادة تعليق خلايا التحكم الإيجابية في 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع باستخدام الجسم المضاد المضاد ل VSG المسمى بالفلوروفور عند التخفيف المناسب. بعد ذلك ، قم بتعليق حبيبات واحدة متدفقة في 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع مع جسم مضاد أولي مضاد مضاد ل VSG المسمى بالفلوروفور عند التخفيف المناسب.

استخدم التعليق لإعادة تعليق الحبيبات في أنبوب التدفق الثاني مما ينتج عنه أنبوب تجمع واحد. تخلط جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. قم بتدوير الخلايا ثم أضف 800 إلى 1000 ميكرولتر من وسط الثقافة الباردة.

قم بالطرد المركزي للعينات عند أربع درجات مئوية لمدة أربع دقائق عند 5200 مرة جم ثم تخلص من المادة الطافية لإزالة أي جسم مضاد غير مرتبط. اغسل الخلايا بملليلتر واحد من وسط الثقافة ، ثم قم بالطرد المركزي للخلايا. الضوابط الإيجابية والسلبية والخلايا الملطخة المخزنة مسبقا على الجليد.

تخلص من المادة الطافية. بعد ذلك ، أضف 148.5 ميكرولتر من وسط الاستزراع إلى العينات. بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولترا من حبات العد المطلقة ، متبوعا ب 1.5 ميكرولتر من محلول تلطيخ يوديد البروبيديوم.

أعد تعليق كريات التحكم الإيجابية والسلبية ب 175 ميكرولتر من وسط الاستزراع. يمكن الآن تشغيل العينات على مقياس التدفق الخلوي. تظهر مخططات قياس التدفق الخلوي هذه نتائج انفصال الخلايا عن مجموعات المثقبيات المستحثة لإنشاء كسر الحمض النووي مزدوج الخيط مقابل الخلايا غير المستحثة.

تظهر اللوحات اليسرى التشتت الأمامي مقابل الجانب ، مما يسمح بتوضيح الخلايا الحية مقابل الخلايا الميتة والخرز المضاف إلى العينة. يمكن بعد ذلك إنشاء بوابات تحدد هذه الخصائص بناء على خصائص التشتت. تظهر اللوحات اليمنى فقط تلك الخلايا التي يمكن تصنيفها على أنها حية بناء على بوابات التشتت التي تم إنشاؤها في الألواح اليسرى.

كان VSG المهيمن في هذه الحالة هو VSG الثاني. الخلايا التي تلطخ بشكل إيجابي بالنسبة ليوديد البروبيديوم هي خلايا ميتة. وتظهر هذه في منطقتين Q واحد و Q من المؤامرة.

تقع الخلايا التي تلطخ بشكل إيجابي ل VSG السائدة وسلبية ل PI في منطقة Q الثلاثة وهي ملوثات. أخيرا ، الخلايا في Q four هي خلايا حية تلطخ سلبا ل VSG السائد والتي تعتبر محولات. يوضح هذا المخطط ترددات التبديل المرصودة المحسوبة لمجموعات المثقبيات مع فواصل مستحثة مقابل بدون فواصل مستحثة.

مستوى التبديل العشوائي في المختبر منخفض إلى حد ما. في حين أن إحداث كسر ينتج عنه المزيد من الخلايا بشكل ملحوظ ، فإن التحول إلى VSG غير المهيمن. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في حوالي ثلاث ساعات.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم الحفاظ على برودة العينات طوال الوقت وإعادة تعليق الكريات بشكل مناسب خاصة قبل العزل على العمود. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى مثل تسلسل الحمض النووي الريبي للإجابة على أسئلة إضافية مثل ما يتم التعبير عنه VSGs في مجموعة التحول. تستخدم هذه الطريقة عادة لقياس تبديل VSG ، ويمكن استخدامها أيضا لعزل وقياس الطفيليات التي تعبر عن أي بروتين سطحي ذي أهمية.