Name: الكشف عن المثقبية البروسية التبديل البديل البروتين السكري السطح بواسطة المغناطيسي خلية المنشط فرز والتدفق الخلوي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: اكتشف طريقة فرز الخلايا المغناطيسي لعزل المثقبيات الأفريقية المعبّرة عن بروتينات سطحية متغيرة محددة وتحديد المتغيرات النادرة. هذه التقنية تسرّع دراسة التباين المستضدي في الطفيليات.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونود أن نعترف جورج الصليب للحصول على المشورة العامة في الأحياء المثقبيات. وأيد هذا العمل أيضا من قبل مؤسسة بيل وميليندا غيتس الحملة العالمية للتعليم منحة لDS، وجبهة الخلاص الوطني العليا زمالة أبحاث (DGE-1325261) لMRM والمعاهد الوطنية للصحة / NIAID (منحة # AI085973) إلى FNP. نشكر Galadriel الكوخ، مينر للاستخدام من سلالة يحتوي على موقع الجين والاعتراف I-SCEI.

ملاحظة: في جميع أنحاء الداخلي، فمن الضروري للحفاظ على الخلايا على الجليد. وينبغي أيضا أن تستخدم وسائل الإعلام في جميع أنحاء الباردة. حصاد 1. عينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو معلن 427 المثقبيات سلالة الدم إلى كثافة ،5-1٬000٬000 / مل. فمن الأفضل أن تبدأ الثقافات مع عدد قليل من الطفيليات. تدور باستمرار 50 × 10 6 خلايا / عينة لمدة 10 دقيقة في 1500 ز س. تأكد من ترك 1 × 10 6 خلايا في الثقافة في وقت لاحق استخدام عناصر التحكم كما الإيجابية والسلبية الأضداد. ملاحظة: يمكن أيضا أن هذا البروتوكول استخدامها على المثقبيات معزولة من دم الحيوانات (انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة أو صب من أكثر من طاف (ترك حوالي 750 ميكرولتر). نقل الخلايا إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الخلايا في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 5200 x ج في microcentrifuge وإزالة طاف. </li></ol> 2. وضع العلامات المغناطيسي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في 150 مستنبت ميكرولتر (HMI-9 وايمصل عشر مثلا) + الأساسي الأجسام المضادة لمكافحة VSG في التخفيف المناسبة. ملاحظة: يرصد-VSG مكافحة الأجسام المضادة في المنزل واستخدامها في التخفيف من 01:50. من المهم أن استخدام الأجسام المضادة الأولية لمكافحة VSG التي لم يتم المسمى مع fluorophore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا دوامة باستخدام دوامة محول-60 بسرعة 6-8 في غرفة باردة عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. يغسل مع 800 - 1000 ميكرولتر الباردة HMI-9 مع المصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 5200 x ج ونضح طاف. تغسل مع 1 مل HMI-9 مع المصل وتدور على النحو الوارد أعلاه. نضح طاف. بيليه resuspend في 100 ميكرولتر من HMI-9 مع المصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 110 ميكرولتر من خلية المغناطيسي تنشيط الفرز (MSC) ميكروبيدات. استخدام لمكافحة فأر، المضادة للأرنب، أو حبات مكافحة البيوتين بما يتناسب مع الأجسام المضادة لمكافحة VSG الأساسي. اخلط جيدا. خلايا دوامة في غرفة باردة عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما الخلايا vortexing ل، مجموعة واحدة المغناطيسي تنشيط فصل العمود / عينة على المغناطيس الانفصال. يجب التأكد من أن إعادةceptacle (نستخدم أنبوب الطرد المركزي 15 مل) تحت العمود لجمع التدفق من خلال. إعداد جهاز في غرفة باردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل من HMI-9 مع المصل إلى العمود الوزراء. بعد فتيلة مكان أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحت العمود لجمع التدفق من خلال من كل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة 10 دقيقة في الخطوة 2.4، إضافة 800-1،000 ميكرولتر الباردة HMI-9 مع المصل. تدور في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 5200 x ج وإزالة طاف لإزالة الأجسام المضادة غير منضم. تغسل مع 1 مل من HMI-9 مع المصل وتكرار ترك 100 ميكرولتر من طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نفض الغبار أنبوب الطرد المركزي بقوة وفحص أنبوب للتأكد من أن بيليه هو معلق تماما. إضافة 1 مل من HMI-9 مع المصل وماصة صعودا وهبوطا للتأكد من أن الخلايا معلق أيضا. </li></ol> 3. الفصل المغناطيسي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان تستعد الأعمدة كما هو موضح أعلاه. تطبيق الخلايا إلى العمود. جمع التدفق من خلال بخلايا معربا عن VS غير المهيمنج 1 مل من المتوسط ​​+ المثقبيات وعادة ما يستغرق 6-7 دقيقة لتدفق من خلال العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 2X مع 1 مل من HMI-9 مع المصل وجمع التدفق عن طريق الأنبوب نفسه كما في الخطوة 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفجوة التدفق من خلال (3 مل) في اثنين من 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. ملاحظة: هذه يمكن أن تكون مجتمعة في وقت لاحق أو نصف يمكن استخدامها لعزل الحمض النووي الريبي، الخ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عمود من المغناطيس. إضافة 3 مل من HMI-9 مع المصل إلى عمود وعمود يغرق في أنبوب 15 مل الطرد المركزي للحصول على خلايا التي تعبر عن الانطلاق، المهيمن VSG. إزالة 300 ميكرولتر من المواد مزال لتحليلها لاحقا. تبقى هذه الخلايا على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاستخدامها بوصفها إيجابية ومراقبة سلبية، واتخاذ ما يقرب من 1 مليون خلية من ثقافة ابتداء من خلايا سيطرة متزايدة على 37 درجة مئوية (التي لا يتوقع أن التبديل في كثير من الأحيان) وماصة لهم في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. ملاحظة: سوف تكون ملطخة الخلايا السيطرة الإيجابية مع الأجسام المضادة المسمى fluorophore في الخطوة 4.1. سلبي الخلايا السيطرة ريمافي غير ملوثين خلال الفترة المتبقية من البروتوكول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات تدور التدفق من خلال وإيجابية العينة الضابطة الأجسام المضادة عند 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 5200 x ج وإزالة طاف. ملاحظة: آخر قسامة 300 ميكرولتر من خلايا مزال يمكن استخدامها كوسيلة لمراقبة إيجابية لمكافحة VSG تلطيخ. </li></ol> 4. تلطيخ في التعرف على الملوثات والتي تتيح أفضل طريقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات التدفق من خلال و resuspend والخلايا السيطرة الإيجابية في 100 ميكرولتر من HMI-9 مع المصل + الابتدائي، وصفت fluorophore، الأجسام المضادة لمكافحة VSG في التخفيف المناسبة. ملاحظة: يرصد المسمى مكافحة VSG الأجسام المضادة في المنزل واستخدامها في التخفيف من 1: 1000. وصفت fluorophore، ويمكن مكافحة VSG يكون من المصدر نفسه والأضداد توضيحها في الفصل بالاعمال step.There يجب أن يكون 3 مل من عينة التدفق من خلال في اثنين من أنابيب microcentrifuge التالية خطوة 3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل كل من التدفق من خلال التدفق الخلوي، والجمع بين الكريات في أنابيب microcentrifuge اثنين حين إعادة سوس-بانتظار العينات في 100 ميكرولتر من HMI-9 مع المصل + مكافحة VSG الأجسام المضادة. اخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا دوامة في غرفة باردة عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. إضافة 800 - 1000 ميكرولتر الباردة HMI-9 مع المصل. عينات تدور في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 5200 x ج وإزالة طاف لإزالة الأجسام المضادة غير منضم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع 1 مل من HMI-9 مع المصل. عينات تدور في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 5200 x ج وإزالة طاف. خلال هذه تدور الماضي، وتدور أسفل-عينات مزال من الخطوة 3.4 وعينة السيطرة السلبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend كل التدفق من خلال عينات مزال في: 148.5 ميكرولتر HMI-9 مع المصل، 25 ميكرولتر الخرز العد المطلق و 1.5 ميكرولتر التأيد Propidium تلطيخ حل (175 ميكرولتر المجموع). و resuspend العينات الإيجابية والسلبية مراقبة الأجسام المضادة في 175 ميكرولتر HMI-9 مع المصل. تأكد من تسجيل عدد من الخرز العد المطلقة / 25 ميكرولتر من أجل الكثير معين المستخدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل جميع العينات من خلال قياس التدفق الخلوي وجمع البيانات. الخلايا الميتة وصمة عار كما PI <sup&gt; +. الملوثات وصمة عار كما PI - VSG +. المحولات وصمة عار كما PI - VSG - 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب تبديل الترددات باستخدام التدفق الخلوي البيانات. ملاحظة: للحصول على إرشادات حول كيفية حساب الترددات التحول، يرجى الرجوع إلى ملف إضافي <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54715/Flow_Cytometry_Calculations.docx" target="_blank">التدفق الخلوي Calculations.docx</a> والجدول 1. </li></ol>

<ol><li>Horn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+in+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation in African trypanosomes.</a> Molecular & Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).</li>
<li>Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+antigen+switching+rates+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).</li>
<li>Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+exchange+can+be+an+important+mechanism+of+variant+surface+glycoprotein+gene+switching+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 80 (1), 65-75 (1996).</li>
<li>Turner, C. M., Barry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei+rhodesiense+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections.</a> Parasitology. 99 (Pt 1), 67-75 (1989).</li>
<li>Miller, E. N., Turner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+antigenic+types+appearing+in+first+relapse+populations+of+clones+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 82 (1), 63-80 (1981).</li>
<li>Horn, D., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Trypanosoma+brucei+vsg+expression+site+switching+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro.</a> Mol Biochem Parasitol. 84 (2), 189-201 (1997).</li>
<li>Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+histone+methyltransferase+modulates+antigenic+variation+in+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes.</a> PLoS Biol. 6 (7), e161(2008).</li>
<li>Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast-endonuclease-generated+DNA+break+induces+antigenic+switching+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 459 (7244), 278-281 (2009).</li>
<li>Engstler, M., Pfohl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+Flow-Mediated+Protein+Sorting+on+the+Cell+Surface+of+Trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes.</a> Cell. 131 (3), 505-515 (2007).</li>
<li>Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+dynamics+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei.</a> Science. 347 (6229), 1470-1473 (2015).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

وفيما يتعلق تقنية تجريبية، وأهم عنصر من البروتوكول هو الحفاظ على جميع العينات البرد. المثقبيات استيعاب بسرعة كبيرة الأجسام المضادة بد أن سطحها 9، ولكن هذه العملية هو الحركة التي تعتمد، ولا تؤثر على فحص طالما يتم الاحتفاظ الخلايا في 4 درجات مئوية. وينبغي دائما أن تبقى جميع العينات على الجليد، وينبغي أن يتم pipetting لبسرعة للحد من التعرض إلى 25 ° C بيئة المختبر. يجب أن تكون باردة HMI-9 مع المصل متوفر في بداية التجربة ويجب أن تبقى على الجليد طوال الوقت. ويجب أن يتم بمعزل ...

وطفيلي، المثقبيات البروسية، هو العامل المسبب للأمراض التي تصيب الإنسان (عبر المثقبية البروسية الغامبية والمثقبية البروسية الروديسية) والحيوانات (عبر المثقبية البروسية البروسية) في جميع أنحاء أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى. وينتقل المرض إلى المضيف الثدييات عن طريق اللعاب من ناقلات ذبابة التسي تسي. كل من الإنسان وداء المثقبيات الأفريقي الحيوانية تسبب عبئا اقتصاديا كبيرا في المناطق الموبوءة، وقليلة الأدوية المتاحة أو في مجال التنمية لعلاج إما المرض. فهم آليات التهرب المناعة أمر بالغ الأهمية لتطوير عقاقير لداء المثقبيات. تباين الأنتيجين للكثيفة، سطح البديل البروتين السكري (VSG) معطف الذي يغطي الطفيلي هو إحدى الوسائل الرئيسية التي T. البروسية يتهرب استجابة الأجسام المضادة الثدييات. وجود ما يقرب من 2000 أنواع من الجينات VSG في الجينوم المثقية، ولكن كتب واحد فقط في أي وقت من الأوقات من أحد ~ 15 مورينداتاهيتيانونيمواقع سيون. &quot;التبديل&quot; من VSG أعرب يمكن أن يحدث إما عن طريق نسخ الجين VSG في الموقع التعبير النشط، أو عن طريق تفعيل النسخي من موقع تعبير صامت سابقا (إعادة النظر في 1). على الرغم من الكثير من العمل وقد كرس لفهم الاختلاف الأنتيجين في T. البروسية، والعوامل التي تؤثر على تردد التبديل لا تزال غير مفهومة. تعرقلت الدراسات حتى الآن من حقيقة أنه في حين أن يحدث التحول عشوائيا في المختبر، ترددات التحول منخفضة جدا، بناء على أمر من 1 في حوالي 10 6 خلايا 2. وهذا يجعل من الصعب قياس ما إذا كان إعطاء زيادة عامل أو تنخفض وتيرة التحول، منذ التحول من الصعب كشف في المقام الأول. قبل عام 2009، كانت طرق لعزل المحولات في عدد معين من السكان طويلة وكثيفة العمالة. هذه الركض المثقبيات من خلال الفئران تحصين ضد VSG المهيمن ومن ثم حصاد الخلايا شملتفي اليوم التالي 3، أو عد مئات من الخلايا المناعي 4،5. وتعتمد استراتيجية أخرى في الاختيار لمقاومة المخدرات لعزل المحولات 6. لأن المثقبيات الأفريقي نمت في المختبر يتم عادة تتكون من عدد كبير من السكان معربا عن البديل رئيسي واحد، ويبلغ عدد سكانها أقل بكثير من المحولات التعبير عن المتغيرات بديلة، نشير إلى البديل الرئيسي في هذه الورقة باعتبارها المهيمنة، بدءا VSG. في القيام بذلك، ونحن في أي وسيلة ترغب في الإيحاء بأن هذا البديل الرئيسي لديه لياقة بدنية أكبر من المتغيرات الأخرى في عدد السكان. نحن هنا تصف طريقة التي يمكن قياس موثوق عدد المثقبيات تعبر عن VSG غير المهيمن في عدد معين من السكان في 3-4 ساعة. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لعند واحد يريد التأكد ما إذا كان التلاعب الجيني معين أو العلاج من تعاطي المخدرات يزيد من عدد الخلايا تحولت في عدد السكان. بدلا من تخليص السكان من الخلايا معربا عن افعلminant، بدءا VSG من خلال العقاقير أو عن طريق المناعية، يتم التخلص من هذه الخلايا عن طريق طلاء لهم أولا مع حبات مغناطيسية بالإضافة إلى الأجسام المضادة ضد VSG المهيمن ومن ثم عزلهم على عمود المغناطيسي. السكان تحولت بعد ذلك جمع في التدفق من خلال وملطخة مرة أخرى مع fluorophore المسمى الأجسام المضادة لمكافحة VSG لتحديد الملوثات. ويتحقق الكمي من خلال إضافة عدد محدد من الخرز العد المطلقة على كل عينة بحيث نسبة من الخرز إلى خلايا يمكن تحديد وتستخدم لتحديد عدد من المحولات في عدد السكان 7.

الجسم <table><tbody><tr><td>المضاد غير المسمى المضاد ل VSG</td><td>n / a</td><td>n / a</td><td>يتكون الجسم المضاد VSG في المنزل</td></tr><tr><td>الفلوروفور المسمى الجسم المضاد المضاد ل VSG</td><td>n / a</td><td>n / a</td><td>الجسم المضاد VSG مصنوع في المنزل</td></tr><tr><td>HMI-9 media</td><td>n / a</td><td>n / a</td><td>HMI-9 مصنوع في المنزل</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>BD Pharmingen</td><td>556463</td><td></td></tr><tr><td>CountBright حبات العد</td><td>المطلق Thermofisher أعمدة Scientific</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>LD</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>مغناطيس MACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MACS فاصل مغناطيسي</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>محول دوامة -60</td><td>ThermoFisher مقياس</td> التدفق <td>الخلوي AM10014</td><td></td></tr><tr><td></td><td>العلمي Coulter</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>برنامج تحليل مقياس التدفق</td><td>الخلوي FloJo</td><td>n / a</td><td></td></tr></tbody></table>

الكشف عن<em&gt; المثقبية البروسية</em&gt; التبديل البديل البروتين السكري السطح بواسطة المغناطيسي خلية المنشط فرز والتدفق الخلوي

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

المثقبية البروسية ، وهو طفيلي أولي يسبب كلا من داء المثقبيات الأفريقي البشري والحيواني (المعروف باسم مرض النوم والناجانا ، على التوالي) بين ناقل التسي تسي ومضيف الثدييات. يتهرب من الجهاز المناعي المضيف للثدييات عن طريق التبديل الدوري للبروتين السكري السطحي الكثيف المتغير (VSG) الذي يغطي سطحه. يمكن أن يكون اكتشاف التباين المستضد في المثقبية البروسي مرهقا وكثيف العمالة. هنا ، نقدم طريقة لقياس عدد الطفيليات التي "تحولت" للتعبير عن VSG جديد في مجموعة سكانية معينة. يتم تلطيخ الطفيليات أولا بجسم مضاد ضد VSG المبدئي ، ثم تلطيخها بجسم مضاد ثانوي متصل بحرزة مغناطيسية. ثم يتم فصل الطفيليات التي تعبر عن VSG البداية عن بقية السكان عن طريق تشغيل الطفيليات فوق عمود متصل بمغناطيس. يتم الاحتفاظ بالطفيليات التي تعبر عن VSG المهيمن على العمود ، بينما يحتوي التدفق على طفيليات تعبر عن VSG جديد بالإضافة إلى بعض الملوثات التي تعبر عن VSG الأولي. يتم تلطيخ هذه المجموعة المتدفقة مرة أخرى بجسم مضاد مصنف بالفلورسنت ضد VSG المبدئي لتسمية الملوثات ، ويوديد البروبيديوم (PI) ، الذي يصنف الخلايا الميتة. يضاف عدد معروف من حبات العد المطلقة التي يمكن رؤيتها عن طريق قياس التدفق الخلوي إلى مجموعة التدفق. يمكن بعد ذلك استخدام نسبة الخرزات إلى عدد الخلايا التي تم جمعها لاستقراء عدد الخلايا في العينة بأكملها. يستخدم قياس التدفق الخلوي لتحديد عدد المحولات عن طريق حساب عدد الخلايا السالبة PI التي لا تلطخ بشكل إيجابي لبدء VSG السائد. يمكن بعد ذلك حساب نسبة المحولات في السكان باستخدام بيانات قياس التدفق الخلوي.

تم استخدام أسلوب الموصوفة هنا لإثبات أن فواصل المزدوج حبلا داخل الموقع التعبير VSG زيادة عدد المحولات في عدد سكانها 8. هنا، وتبين لنا نتائج ممثل من سكان المثقبيات التي تم بفعل مماثل لتوليد مزدوج الجديلة في موقع التعبير. قارنا هذه المثقبيات إلى تلك التي لم يحملوا على توليد مزدوج الجديلة. ويبين الشكل 1 تدفق التمثيلي الخلوي المؤامرات من خلايا الامم المتحدة والتي يسببها والتي يسببها التي تم جمعها في التدفق من خلال المغناطيسي...

تخضع المثقبيات الأفريقية المثقبيات الأفريقية المزروعة في المختبر لتباين مستضد بمعدل منخفض ، بحيث تتكون السكان من طفيليات تعبر عن نوع البروتين السكري السطحي المتغير السائد (VSG) ومجموعة صغيرة من المتغيرات "المبدلة". يصف هذا البروتوكول طريقة سريعة لاكتشاف هذه المجموعات وقياسها.

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

الهدف العام من هذه الطريقة هو عزل التريبانوسوما التي تعبر عن بروتين سكري سطحي متغير (VSG) محدد من بقية المجتمع، وتحديد الطفيليات التي تحولت من الـ VSG السائد في البداية إلى أي VSG آخر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في بيولوجيا التريبانوسوما، مثل العوامل أو الأحداث التي تؤثر على تبديل الـ VSG في مجتمع من الطفيليات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها أسرع من الطرق المنشورة سابقًا وتسمح بالقياس الكمي السهل للخلايا التي حدث لها تبديل مقابل الخلايا التي لم يحدث لها تبديل.عندما بدأ المختبر العمل لأول مرة على التباين المستضدي، كانت المشكلة الأولى هي كيفية الكشف عن الخلايا النادرة التي حدث لها تحول. في الواقع، كانت هذه النوعية من المشكلات قد حُلت في علم المناعة منذ عدة سنوات، من خلال استخدام فرز الخلايا المنشط مغناطيسياً لإثراء الخلايا التي كانت سلبية لسمة معينة. وبدا نقل عملية عدم الاختيار هذه إلى التباين المستضدي فكرة واعدة حقاً.للبدء، يجب تنمية التريبانوسوما الدموية من سلالة Lister 427 حتى تصل كثافتها إلى 0.5 إلى 100,000 لكل ملليلتر. يتم أخذ عينة مكونة من 50 × 10⁶ خلية ووضعها في أنبوب سعة 15 ملليلتر ثم إجراء عملية الطرد المركزي. يتم الاحتفاظ بـ 1 × 10⁶ خلية ومزرعتها لاستخدامها لاحقاً كضوابط أجسام مضادة إيجابية وسلبية.اسحب معظم السائل الطافي باستخدام الماصة، مع ترك حوالي 750 microliters في الأنبوب. انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 milliliters. وأخيراً، قم بطرد الخلايا مركزياً عند درجة حرارة أربع درجات Celsius لمدة أربع دقائق بسرعة 2800 ×g.ثم يتم سحب كل السائل الطافي باستخدام الماصة. أعد تعليق الخلايا في 150 µL من وسط الزراعة، مضافاً إليه الجسم المضاد الأولي ضد البروتين السكري السطحي المتغير (anti variant surface glycoprotein antibody) أو anti VSG بالتخفيف المناسب. بعد ذلك، قم برج الخلايا بجهاز الفورتكس عند درجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق.اغسل الخلايا باستخدام 800 إلى 1000 µL من وسط استزراع مبرد. قم بطرد الخلايا مركزياً عند درجة حرارة 4 °C لمدة 4 دقائق بسرعة 5200 ×g. بعد سحب السائل الطافي، اغسل الخلايا بـ 1 mL من وسط الاستزراع ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى.أزل الطافي وأعد تعليق الراسب في 100 µL من وسط الزرع. أضف 110 µL من الخرزات الدقيقة لفرز الخلايا بالتنشيط المغناطيسي من النوع المناسب للأجسام المضادة الأولية. اخلط جيداً عن طريق السحب والضخ بالماصة ثم استخدم جهاز الرج المداري (vortex).أثناء عملية مزج الخلايا بجهاز الفورتيكس، قم بتجهيز عمود فصل منشط مغناطيسياً. ضع أنبوباً سعة 15 milliliter أسفله لتجميع وسط التهيئة. أضف 2 milliliters من وسط الزراعة لتهيئة العمود.بعد ذلك، قم بإخراج العينة من جهاز الرج vortex وأضف من 800 إلى 1000 µL من وسط زراعة بارد. قم بطرد العينة مركزياً ثم تخلص من السائل الطافي لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة. اغسل الخلايا المترسبة باستخدام 1 mL من وسط الزراعة ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى.قم هذه المرة بشفط السائل الطافي مع ترك 100 µL في الأنبوب. هز أنبوب الطرد المركزي بقوة حتى يتم إعادة تعليق الراسب بالكامل. أضف 1 mL من وسط الزرع واستخدم الماصة في عملية السحب والدفع لإعادة تعليق الخلايا بالكامل.قم بإزالة الأنبوب المخروطي سعة 15 مليمتر المستخدم لجمع وسط التحضير واستبدله بأنبوب مخروطي جديد سعة 15 ملي لتر لجمع السائل المار الذي يحتوي على الطفيليات التي تم تحويلها. ضع معلق الخلايا على العمود الذي تم تحضيره. اجمع السائل المار في أنبوب سعة 15 ملي لتر في الأسفل، وعادةً ما تستغرق هذه العملية من ست إلى سبع دقائق لكل 1 ملي لتر من الوسط بالإضافة إلى التريبانوسومات.بعد ذلك، اغسل العمود مرتين باستخدام 1 ml من وسط الزرع واجمع السائل المتدفق في نفس الأنبوب. قم بتقسيم السائل المتدفق، والذي يجب أن يصل إجماليه إلى 3 ml تقريبًا، إلى أنبوبين من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ml. ثم، ضع الأنابيب على الثلج.أضف ثلاثة مليلتر من وسط المزرعة إلى العمود ثم أغمس العمود في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر. سيؤدي ذلك إلى الحصول على الخلايا التي تعبر عن VSG السائد الأولي. اسحب 300 ميكرولتر من هذه المادة المستخلصة واحفظها على الثلج، ويمكن التخلص من الكمية المتبقية.لإنشاء ضابط موجب، خذ حوالي 100,000 خلية من المزرعة الخلوية الأصلية وانقلها باستخدام الماصة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter. كرر هذه الخطوة لإنشاء ضابط سالب. قم بطرد عينات التدفق المار وعينة الضابط الموجب مركزياً.ثم قم بإزالة السائل الطافي والتخلص منه. أعد تعليق خلايا الضابط الموجب في 100 Microlitres من وسط الزرع مع جسم مضاد أولي مضاد لـ VSG وموسوم بفلوروفور بالتخفيف المناسب. بعد ذلك، أعد تعليق إحدى كتل التدفق في 100 microliters من وسط الزرع مع جسم مضاد أولي مضاد لـ VSG وموسوم بفلوروفور بالتخفيف المناسب.استخدم المعلق لإعادة تعليق الراسب في أنبوبة التدفق الثانية، مما ينتج عنه أنبوبة تجميع واحدة. اخلط جيداً عن طريق السحب والدفع بالماصة. قم برج الخلايا باستخدام جهاز الـ Vortex ثم أضف من 800 إلى 1000 µL من وسط استنبات بارد.قم بطرد العينات مركزياً عند درجة حرارة 4 °C لمدة 4 دقائق بسرعة 5200 ×g، ثم تخلص من السائل الطافي لإزالة أي أجسام مضادة غير مرتبطة. اغسل الخلايا باستخدام 1 mL من وسط الزرع، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً. يتم استخدام الضوابط الموجبة والسالبة والخلايا المستخلصة التي تم تخزينها مسبقاً على الثلج.تخلص من الراشح. بعد ذلك، أضف 148.5 µL من وسط الزرع إلى العينات. بعد ذلك، أضف 25 µL من حبيبات العد المطلقة، متبوعة بـ 1.5 µL من محلول صبغ Propidium Iodide.أعد تعليق رواسب الضوابط الموجبة والسالبة باستخدام 175 µL من وسط الزرع. يمكن الآن تشغيل العينات على جهاز قياس التدفق الخلوي. تُظهر مخططات قياس التدفق الخلوي هذه نتائج فصل الخلايا من مجموعات من الـ trypanosomes التي تم تحفيزها لإحداث كسر مزدوج في شريط DNA مقارنة بالخلايا غير المحفزة.تظهر اللوحات الموجودة على اليسار التشتت الأمامي مقابل التشتت الجانبي، مما يسمح بتوضيح الخلايا الحية مقابل الخلايا الميتة والخرز المضاف إلى العينة. يمكن بعد ذلك إنشاء بوابات تحدد هذه العناصر بناءً على خصائص التشتت. وتظهر اللوحات الموجودة على اليمين فقط تلك الخلايا التي يمكن تصنيفها على أنها حية بناءً على بوابات التشتت التي تم إنشاؤها في اللوحات الموجودة على اليسار.كان البروتين السكري السطحي (VSG) البادئ السائد في هذه الحالة هو VSG two. أما الخلايا التي تُصبغ إيجابياً بصبغة يوديد البروبيديوم فهي خلايا ميتة، وتظهر هذه الخلايا في منطقتي Q one و Q two من المخطط.تُصنف الخلايا التي تُظهر صبغاً إيجابياً لـ VSG السائد وصبغاً سلبياً لـ PI ضمن منطقة Q three وتُعد ملوثات. وأخيراً، فإن الخلايا في Q four هي خلايا حية تُظهر صبغاً سلبياً لـ VSG السائد، وتُعتبر هذه الخلايا "مبدِّلات". يوضح هذا المخطط ترددات التبديل الملحوظة المحسوبة لمجموعات trypanosomes مع وجود كسور محفزة مقابل عدم وجودها.يُعد مستوى التبديل العشوائي في المختبر منخفضاً إلى حد ما. وبينما يؤدي تحفيز حدوث كسر إلى زيادة عدد الخلايا التي تتحول إلى VSG غير السائد بشكل ملحوظ. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ثلاث ساعات تقريباً.أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم الحفاظ على برودة العينات طوال الوقت وإعادة تعليق الرواسب بشكل كافٍ، خاصة قبل عملية العزل على العمود. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن استخدام طرق أخرى مثل تسلسل RNA للإجابة على أسئلة إضافية، مثل تحديد أي من البروتينات السكرية المتغيرة (VSGs) يتم التعبير عنها في مجموعة متحولة. وبالإضافة إلى استخدام هذه الطريقة عادةً لقياس تحول البروتينات السكرية المتغيرة (VSG switching)، يمكن استخدامها أيضاً لعزل وتقدير كمية الطفيليات التي تعبر عن أي بروتين سطحي مستهدف.

detection-trypanosoma-brucei-variant-surface-glycoprotein-switching

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

ويستخدم نظام مغناطيسي لتعديل biosensing بسرعة ، بحساسية وبساطة كشف المقايسات البيولوجية ، مثل جزيئات الحمض النووي والبروتينات.

متجانسة الكشف السريع عن طريق فحوصات البيولوجي المغناطيسي نظام Biosensing التحوير

وهناك طريقة لعزل الكريات البيض التهابات الأوعية الدموية الملتصقة من الدماغ...

العزلة وتحليل الدماغ المعزول من الكريات البيضاء<em&gt; المتصورة berghei</em&gt; ANKA الفئران المصابة

ويغزو الطفيلي الملاريا ومكررات داخل خلايا الدم الحمراء. تقييم دقيق للغزو أقسومة والطفيل هو بالتالي حاسما في تقييم مسار عدوى الملاريا. نحن هنا وصف التدفق الخلوي بروتوكول أساس لقياس هذه المعايير في نموذج الفأر من الملاريا.

في تقييم فيفو من القوارض المتصورة الطفيل وأقسومة الغزو من قبل التدفق الخلوي

تصف هذه المخطوطة استخدام سلالة مضيئة بيولوجيا من المثقبيات الأفريقية لتمكين تتبع العدوى في المرحلة المتأخرة وتوضح كيف يمكن استخدام التصوير الحي في الجسم الحي لتصور الالتهابات داخل الجهاز العصبي المركزي في الوقت الفعلي.

تلألؤ بيولوجي التصوير لكشف العدوى المرحلة المتأخرة من داء المثقبيات الأفريقي

تعد إضافة علامة إلى البروتين طريقة قوية لاكتساب نظرة ثاقبة لوظيفته. هنا ، نصف بروتوكولا لوضع علامات داخلية على المئات من بروتينات المثقبية البروسية بالتوازي بحيث يمكن تحقيق علامات مقياس الجينوم.

الإنتاجية العالية جين توصيف في<em&gt; المثقبية البروسية</em

تم التقاط الفيروسات أو الحويصلات خارج الخلية بخلايا نانوية مغناطيسية 15 نانومتر مقترنة بالأجسام المضادة التي تتعرف على المستضدات السطحية. تم تصنيف الفيروسات أو الحويصلات التي تم التقاطها بأجسام مضادة فلورية ضد مستضدات سطحية أخرى. تم فصل المجمعات الناتجة في مجال مغناطيسي عال وتحليلها باستخدام مقاييس التدفق الخلوي التقليدية التي يتم تشغيلها عند التألق.

تدفق Virometry لتحليل الأنتيجين أطياف Virions وخارج الخلية الحويصلات

هذا الأسلوب من المثقبيات انفصال الدم يعتمد على تهمة السطحية يجري أقل سلبية من الثدييات خلايا الدم. وضع الدم الملوث ويعامل على عمود مبادل شاردة. يوفر هذا الأسلوب، الأكثر ملائمة في التشخيص لداء المثقبيات الأفريقي، الطفيليات المنقي للتحقيقات المناعية، والبيولوجية، والكيميائية الحيوية، الصيدلة والبيولوجيا الجزيئية.

تنقية مثقبيات خارج الخلية، بما في ذلك البلدان الأفريقية، من الدم بشاردة-مبادلات (ديثيلامينوثيل-السليلوز أعمدة)

غرامة إبرة الطموح هو تقنية، حيث يتم الحصول على الخلايا من آفة أو عضو باستخدام إبرة رقيقة. يتم تشويه المواد المستنشقة، ملطخة وفحصها تحت المجهر للتشخيص أو استخدامها للبيولوجيا الجزيئية، قياس الخلايا أو التحليل في المختبر. انها رخيصة وبسيطة وسريعة ويسبب الحد الأدنى من الصدمة.

الكشف عن طفيليات التربانوسوما خارج الأوعية الدموية عن طريق الشفط الإبرة الدقيقة

الهدف العام لهذا البروتوكول هو توفير تعليمات حول كيفية قياس قدرة الأجسام المضادة الموجودة في سيرا أو البلازما للأفراد ، المعرضين بشكل طبيعي لعدوى بالسيباروم البلازمودي ، لopsonize والحث على البلعميات الحمراء المصابة بالطفيليات (IEs).

قياس المكتسبة بشكل طبيعي Phagocytosis-تحريض الأجسام المضادة لبلاموديوم فالسيباروم الطفيليات من قبل تدفق Cytometry القائم على المقايسة

تم فحص طفيليات الدم الطبية في جميع أنحاء العالم تلقائيا باستخدام خطوات بسيطة على منصة الذكاء الاصطناعي منخفضة التعليمات البرمجية. تم تحسين التشخيص المستقبلي لأغشية الدم باستخدام طريقة الكشف عن الأشياء وتصنيفها في نموذج التعلم العميق الهجين. يساعد التعاون بين المراقبة النشطة والنماذج المدربة تدريبا جيدا على تحديد النقاط الساخنة لانتقال المثقبيات.

التعرف التلقائي الفائق على طفيليات المثقبيات باستخدام نموذج التعلم العميق الهجين

وصفنا طريقة لدراسة كيفية استجابة الأس الهيدروجيني للإشارات البيئية في جليكوسومات مجرى الدم من المثقبيات الأفريقية. يتضمن هذا النهج مستشعر بروتين وراثي حساس لدرجة الحموضة مع قياس التدفق الخلوي لقياس ديناميكيات الأس الهيدروجيني ، سواء كفحص زمني أو في شكل شاشة عالية الإنتاجية.

قياس التغيرات الديناميكية في درجة الحموضة الجليكوزومية في المثقبيات الحية بروسي

اكتشف طريقة فرز الخلايا المغناطيسي لعزل المثقبيات الأفريقية المعبّرة عن بروتينات سطحية متغيرة محددة وتحديد المتغيرات النادرة. هذه التقنية تسرّع دراسة التباين المستضدي في الطفيليات.

الكشف عن

استكشف المزيد من الفيديوهات