تحليل استيراد البروتين في البلاستيدات الخضراء المعزولة من النباتات وشدد

الهدف العام لهذه المنهجية هو دراسة استيراد البروتينات المشفرة للنواة إلى البلاستيدات الخضراء مع التركيز بشكل خاص على آثار الإجهاد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البلاستيدات الخضراء ، مثل كيفية تنظيم استيراد بروتين البلاستيدات الخضراء. تتمثل إحدى المزايا الخاصة لهذه التقنية في أنها تسمح بتقييم آثار الإجهاد على استيراد بروتين البلاستيدات الخضراء.

على الرغم من أن هذه الطريقة قد تم تطويرها للاستخدام مع نبات نبات الأرابيدوبسيس الثاليانا، إلا أنه يمكن تعديلها وتكييفها للاستخدام مع أنظمة أخرى، مثل نباتات المحاصيل. سيوضح الإجراء Qihua Ling ، باحث ما بعد الدكتوراه من مختبري. للبدء ، قم أولا بزراعة نباتات نبات الأرابيدوبسيس كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب.

ثم عندما يبلغ عمر النباتات ثمانية أيام ، قم بإجراء علاج الإجهاد. اكشط النباتات برفق من صفيحة أجار يدويا ، وضعها في قارورة معقمة من وسط MS السائل الذي يحتوي على مادة الضغوط. قد يكون من الضروري أيضا وضع نباتات إضافية في قارورة مماثلة بدون ضغط كعنصر تحكم ، اعتمادا على طبيعة التجربة.

قم بتغطية فم القوارير بورق معقم واترك النباتات تنمو لمدة يومين إضافيين على شاكر مداري مع اهتزاز لطيف. قم بإعداد تدرج كثافة مستمر عن طريق خلط 13 مل من Percoll أولا ، و 13 مل من اثنين × عازلة لعزل البلاستيدات الخضراء ، وخمسة ملليغرامات من الجلوتاثيون في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. ثم الطرد المركزي الخليط.

بعد الطرد المركزي ، تعامل مع الأنبوب بعناية لتجنب إزعاج التدرج ، واحتفظ به على الجليد لاستخدامه لاحقا. بعد ذلك ، انقل 100 مل من المخزن المؤقت لعزل البلاستيدات الخضراء لكل حالة إلى دورق سعة لتر واحد. قم بإزالة الشتلات من الوسط السائل عن طريق قلبها في غربال.

ثم انقلها إلى الدورق الذي يحتوي على عازلة عزل البلاستيدات الخضراء. اشطف المنديل بالمخزن المؤقت لإزالة أي وسط متبقي ، ثم استبدل المخزن المؤقت ب 100 مل من عازلة العزل الطازجة. في الجولة الأولى من التجانس ، انقل الأنسجة النباتية إلى دورق سعة 50 مليلتر يدويا ، مما يسمح للمخزن المؤقت السابق بالتصريف من خلال أصابعك.

ثم ضع مسبار مجانس الأنسجة في الأنسجة وقم بتجانس بنبضتين من ثانية إلى ثانيتين لكل منهما. قم بتصفية الجانس من خلال طبقتين من قماش الترشيح في أنبوب طرد مركزي سعة 250 مل. انتهي بالضغط برفق على القماش.

احتفظ بالمرشح وانقل الأنسجة النباتية مرة أخرى إلى دورق سعة 50 مل. ثم ضع 20 مل ثانية من المخزن المؤقت لعزل البلاستيدات الخضراء في دورق سعة 50 مليلتر وأضف أي أنسجة متبقية لم يتم استخدامها في الجولة الأولى من التجانس. كرر خطوات التجانس والترشيح أربع مرات أخرى.

الطرد المركزي المتجانس المجمع عند 1 ، 000 مرة جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. اسكب المادة الطافية مباشرة بعد الطرد المركزي ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات. ضع الأنبوب على الجليد وأعد تعليق الحبيبات في المادة الطافية المتبقية عن طريق تحريك الأنبوب برفق.

بعد ذلك، استخدم ماصة باستور لنقل المتجانس برفق إلى الجزء العلوي من تدرج الكثافة المستمر الجاهز عبر جدار أنبوب الاستقبال. ثم قم بالطرد المركزي للعينة والتدرج في دوار دلو متأرجح عند 7 ، 800 مرة جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية مع إيقاف تشغيل الفرامل. عند الانتهاء ، لاحظ الشريطين الأخضرين اللذين يمكن رؤيتهما في التدرج.

تخلص من النطاق العلوي، الذي يحتوي على البلاستيدات الخضراء المكسورة، واستخدم ماصة باستور لنقل النطاق السفلي الذي يحتوي على البلاستيدات الخضراء السليمة إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 ملليلترا. بعد ذلك ، أضف 25 مل من المخزن المؤقت HMS في الأنبوب ، واقلب الأنبوب مرتين لغسل Percoll من البلاستيدات الخضراء. ثم ضع الأنبوب مرة أخرى في دوار الجرافة المتأرجحة وأعد تكسير البلاستيدات الخضراء.

اسكب المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت المتبقي عن طريق تحريك الأنبوب برفق على الجليد. أضف 100 إلى 300 ميكرولتر إضافي من المخزن المؤقت HMS إذا لزم الأمر ، لكن حاول ألا تخفف العينة كثيرا. قم بتخزين البلاستيدات الخضراء المعلقة على الثلج.

ابدأ بإضافة خمسة ميكرولترات من البلاستيدات الخضراء المعزولة إلى 495 ميكرولتر من المخزن المؤقت HMS في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. اقلب الأنبوب لخلط المحلول برفق. ثم ضع غطاء زجاجي أعلى غرفة العد في مقياس الدم.

قم ببسط 40 إلى 60 ميكرولترا من معلق البلاستيدات الخضراء المخفف ببطء في الفجوة بين زجاج الغطاء وغرفة العد. باستخدام مجهر تباين الطور ، قم بتصوير البلاستيدات الخضراء بهدف 20x. تبدو البلاستيدات الخضراء السليمة مستديرة ومشرقة وتحيط بها هالة من الضوء.

ثم استخدم هدف 10x لعدد البلاستيدات الخضراء في 10 مربعات كبيرة. وينبغي أن يتراوح متوسط عدد البلاستيدات الخضراء لكل مربع كبير بين 10 و 30. في حالة وجود عدد قليل جدا أو عدد كبير جدا من البلاستيدات الخضراء ، اضبط عامل التخفيف وكرر الإجراء.

بمجرد الوصول إلى النطاق الصحيح ، احسب عدد البلاستيدات الخضراء لكل مليلتر كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. لتشغيل دورة زمنية بثلاث نقاط زمنية ، قم بإعداد ثلاثة أنابيب ، يحتوي كل منها على 130 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإيقاف الاستيراد ، واتركها على الجليد. في أنبوب سعة ملليلتر ، قم بإعداد تفاعل الاستيراد الذي يحتوي على المخزن المؤقت للتفاعل وبروتين المسمى بالراديو.

لاحظ أنه يجب أن يكون هناك تفاعل واحد لكل حالة يتم اختبارها. استخدم ما يقرب من 10 ملايين بلاستيدات خضراء لكل نقطة زمنية. احتضان أنبوب التفاعل عند 25 درجة مئوية في حمام مائي تحت كمية محدودة من الضوء.

من حين لآخر ، قم بنقر الأنابيب لإعادة تعليق البلاستيدات الخضراء. لإجراء دورة زمنية ، مع 130 ملليلتر من النقاط الزمنية المطلوبة ضمن المدى الخطي للاستيراد. فور الانسحاب ، انقل كل 130 ميكرولتر إلى أنبوب من المخزن المؤقت لإيقاف الاستيراد المثلج البارد الممزوج عن طريق النقر برفق على الأنبوب ، وضع الأنابيب على الجليد حتى يكتمل المسار الزمني.

بمجرد إزالة العينة الأخيرة ، قم بالطرد المركزي لجميع العينات لمدة 30 ثانية عند 12،000 مرة جم في جهاز الطرد الصغير. بعد ذلك ، تخلص من المواد الطافية وأعد تعليق الكريات في 15 ميكرولترا من اثنين من المخزن المؤقت لتحميل البروتين. ثم امزج العينات عن طريق الدوامة.

أخيرا ، قم بتحليل جميع العينات ، بالإضافة إلى التحكم في إدخال السلائف ، باستخدام SDS-PAGE القياسي والتصوير الشعاعي الذاتي أو التصوير الفلوري أو التصوير الفوسفوري. PsaD هو مكون 18 كيلوڈالتون من النظام الضوئي الأول يتم تصنيعه كمقدمة أكبر من 23 كيلودالتون. تشير المعالجة إلى الشكل الناضج 18 كيلو دالتون إلى حدوث استيراد إلى البلاستيدات الخضراء.

يحمل طفرة sp1 من نبات الأرابيدوبسيس التي تمت دراستها هنا عيبا في منظم مهم لآلية استيراد بروتين البلاستيدات الخضراء ، وهو بروتين sp1. في ظل ظروف الإجهاد ، تزداد كمية استيراد بروتين PsaD إلى البلاستيدات الخضراء الطافرة sp1 بالنسبة للنوع البري ، ولكن ليس في ظل الظروف العادية غير المجهدة. في حين أن شكل البروتين الناضج ل PsaD تراكم بطريقة تعتمد على الوقت مع البلاستيدات الخضراء من كلا النمطين الوراثيين النباتيين ، كان معدل الاستيراد أعلى بكثير بالنسبة للبلاستيدات الخضراء الطافرة sp1 مقارنة بالبلاستيدات الخضراء من النوع البري.

تشير هذه النتائج إلى دور مهم لبروتين sp1 في تنظيم استيراد بروتين البلاستيدات الخضراء في ظل ظروف الإجهاد. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه الطريقة من عزل البلاستيدات الخضراء حتى الانتهاء من فحص الاستيراد في غضون خمس إلى ست ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إجراء جميع خطوات عزل البلاستيدات الخضراء عند أربع درجات مئوية لضمان احتفاظ البلاستيدات الخضراء بأقصى نشاط.

بعد تطويره الأولي منذ عدة عقود ، مهد اختبار استيراد بروتين البلاستيدات الخضراء في المختبر الطريق للباحثين في هذا المجال لاستكشاف العديد من الجوانب المختلفة لآلية استيراد بروتين البلاستيدات الخضراء. يتيح الصقل المقدم هنا التحقيق في آثار ظروف الإجهاد على استيراد البروتين. لا تنس أن العمل مع المواد المشعة يتطلب عناية خاصة.

يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات ومعطف المختبر ونظارات السلامة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.