الجيل السريع والفعال للخلايا الجذعية متعددة القدرات المؤتلف الإنسان التي تتوسط Recombinase-تبادل كاسيت في AAVS1 الحالة رقم

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء تحرير الجينوم المستهدف السريع والفعال في AAVS1 للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ، أو PSCs البشرية ، باستخدام نهج تبادل الكاسيت بوساطة إعادة التركيب ، أو RMCE. يعمل RMCE على تحسين الإدخال المستهدف لتسلسل في موضع AAVS1 ، وهو أمر ذو أهمية كبيرة لبيولوجيا الخلايا الجذعية لأنه يسمح بإجراء اختبار سريع على وظيفة الجزيء عن طريق الإفراط في التعبير أو الضربة القاضية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن خطوط PSC البشرية خالية من أحداث التكامل العشوائية ، ولا تزال متعددة القدرات وعندما يمكن إنشاء أنماط ناعمة طبيعية في 15 يوما فقط.

توفر هذه الطريقة أداة مفيدة للتحول ، في موضع AAVS1 ولكن يمكن أيضا تطبيقها على مواقع الإنسان المتساهلة الأخرى. للبدء ، قم بزراعة خطوط الخلايا الرئيسية البشرية PSC وفقا للإجراءات القياسية داخل أو إيقاف تشغيل الخلايا الجنينية المعطلة للفأر أو iMEFs ، في ستة ألواح آبار. عندما تصل الخلايا إلى 60٪ إلى 70٪ من iMEFs المقاومة للأدوية للوحة التقاء عن طريق استخدام محلول جيلاتين 0.1٪ أولا لتغطية الآبار اللازمة لصفيحة 12 بئر واحتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، قم بوضع 125 ، 000 iDR4s لكل بئر واحتضان الثقافات بين عشية وضحاها باستخدام وسيط iMEF. في اليوم التالي ، قم باحتضان مزارع PSC البشرية بوسط جديد بما في ذلك 10 مثبطات صخور ميكرومولار عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. في غضون ذلك ، قم بإحضار محلول تعداء ESC البشري وعامل تفكك الخلية إلى درجة حرارة الغرفة.

قم بإعداد مليلتر واحد من وسط طلاء النواة لكل حالة نوة. بعد ذلك ، قم بإزالة وسيط iDR4 من الآبار ، واستخدم ملليلتر واحد من PBS بدرجة حرارة الغرفة لغسل الخلايا وإضافة وسط طلاء النواة. انقل 500 ميكرولتر لكل عينة من متوسط الطلاء إلى أنابيب معقمة سعة 1.5 ملليلتر واحفظها على حرارة 37 درجة مئوية حتى الطلاء.

لفصل PSCs البشرية في معلق خلية واحدة ، قم بإزالة الوسط ، واستخدم PBS بدرجة حرارة الغرفة لغسل الخلايا وإضافة مليلتر واحد من 0.05٪ Trypsin أو Accutase على مزارع hPSC المغذية أو الخالية من المغذيات ، على التوالي. احتضان الثقافات عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة اللوحة بعناية من الحاضنة ودون السماح للخلايا بالانفصال ، قم بشفط عامل التفكك وأضف 1 مليلتر من وسط PSC البشري.

قم بفصل الخلايا الرخوة عن طريق شطف الوسط برفق على سطح اللوحة مع تجنب تكوين الرغوة. اجمع الخلايا في معلق خلية واحدة في أنبوب نظيف ومعقم سعة 15 أو 50 مل. ثم استخدم 1 مليلتر من وسط hESC لغسل الخلايا وجمعها في نفس الأنبوب.

خذ 50 ميكرولتر من تعليق الخلية لعد الخلايا المتبقية وطرد مركزي عند 300 مرة جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. عد الخلايا بجهاز عد الخلايا أثناء خضوع التعليق للطرد المركزي. قم بإزالة المادة الطافية واستخدم PBS بدرجة حرارة الغرفة لإعادة تعليق لون الخلية برفق إلى 10 إلى الخلية السادسة لكل مليلتر.

ثم انقل ملليلترين لكل حالة تجريبية لتنظيف أنابيب معقمة سعة 15 مليلتر وتكرار الطرد المركزي. أثناء دوران العينات ، قم بإعداد خلطات البلازميد في ثلاثة أنابيب نظيفة سعة 1.5 مليلتر بنسب جزيئية فليباز 0: 1 و 2: 1 و 2: 0 باستخدام 2.5 ميكروغرام من بلازميد الفليبباز. للمضي قدما في النواة ، قم بإزالة لوحة iDR4 وأنبوب 1.5 مليلتر مع وسط طلاء من الحاضنة.

أنبوب واحد في كل مرة ، دون إزعاج الحبيبات ، قم بإخراج الماصة بعناية من PBS ، وإزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت. استخدم 100 ميكرولتر من محلول التعدي لإعادة تعليق الحبيبات عن طريق سحب العينة برفق. بعد ذلك ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب 1.5 مليلتر يحتوي على مزيج البلازميد واخلطه برفق.

انقل مزيج الحمض النووي للخلية إلى كوفيت الترانفكتور ، مع الانتباه إلى عدم إدخال الفقاعات. أدخل الكوفيت في جهاز النواة وقم بتشغيل البرنامج A13 للخلايا المزروعة على المغذيات أو F16 للتعداء الخالية من المغذي. قم بإزالة الكوفيت واستخدم ماصات النقل التي تستخدم لمرة واحدة في المجموعة لإضافة 0.5 مل من وسط الطلاء في الكوفيت برفق ، ولكن بسرعة وبحركة واحدة.

بعد ذلك ، استرجع الحجم بنفس الطريقة وقم بتثبيته بشكل متساقط في لوحة 12 بئر تحتوي على iDR4 ووسط الطلاء. ضع طبق الثقافة على رف في الحاضنة وحركه ببطء ذهابا وإيابا ومن جانب إلى آخر لتوزيع تعليق الخلية بالتساوي. احتضن الطبق لمدة 24 ساعة قبل تغيير الوسط.

بعد يومين إلى ثلاثة أيام من التعدي ، ابدأ الاختيار. قم بشفط الوسط ، واستخدم 1 مليلتر من PBS لغسل الخلايا ، ثم أضف وسيط ESC البشري مع 100 نانوغرام لكل مليلتر من البيرومايسين. راقب نمو الخلايا وقم بزيادة تركيز البيورومايسين وفقا لذلك بحد أقصى 250 نانوغرام لكل مليلتر ، مع الاستمرار في اختيار البيورومايسين لمدة سبعة أيام.

بعد ثلاثة إلى أربعة أيام من اختيار بورومايسين، ابدأ الاختيار باستخدام 0.5 ميكرومولار فيالوريدين أو FIAU. قم بتغيير الوسيط يوميا وحافظ على FIAU لمدة لا تزيد عن سبعة أيام متواصلة. بعد الانتهاء من الاختيار ، في حوالي الأيام من 14 إلى 15 ، ستكون مستعمرات RMCE المقاومة موجودة وتشكل خط RMCE الجديد.

قم بتقسيم الخلايا بنسبة 1: 2 باتباع الإجراءات القياسية. عندما تكون الآبار من المفتاح 1 جاهزة للانقسام ، قم بفصل البئر للتوصيف إلى معلق خلية واحدة كما هو موضح سابقا في الفيديو واجمع الخلايا في أنبوب سعة 15 ملليلترا. قم بتدوير الخلايا بمعدل 300 مرة جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، استخدم ملليلتر واحد من PBS لإعادة تعليق الخلايا وتقسيم العينة إلى قسمين. تم ترشيح أحدهما باستخدام مصفاة خلوية لإجراء قياس التدفق الخلوي والآخر لتحليل الحمض النووي وفقا لبروتوكول النص. بعد التعدي باستخدام recombinase flippase والمانح tdT RMCE ، شكلت hPSCs مجموعات صغيرة من الخلايا موزعة بالتساوي على طبقة iDR4 MEF وعبرت عن GFP التأسيسي و tdT العابر.

ويؤدي الانتقاء الإيجابي باستخدام بورومايسين إلى إدراج المتبرع ب RMCE ثم الانتقاء السلبي باستخدام اختيارات FIAU لأحداث إعادة التركيب بوساطة FRT فقط التي تفتقر إلى المعارف التقليدية. في اليوم السادس بعد التعدي ، يمكن تحديد مجموعات صغيرة من الخلايا الإيجابية ل RMCE GFP وإيجابية tdT. كما هو موضح هنا ، فإن مستعمرات RMCE السلبية ل GFP والإيجابية tdT موجودة فقط عند استخدام كل من المتبرع RMCE والفليباز بينما لا يحدث RMCE في حالة عدم وجود فليبباز. يؤكد توصيف قياس التدفق الخلوي لخطوط RMCE التي تم إنشاؤها حديثا ، وهي مستعمرات RMCE المقاومة للبورومايسين و FIAU ، مجتمعة في مجموعة خلايا غير نسيلة أن 100٪ من الخلايا تمثل النمط الظاهري السلبي ل RMCE GFP ، الإيجابي tdT.

عند استخدام المتبرعين RMCE بدون نشاط مسجل في hPSC ، تكون 100٪ من الخلايا سلبية GFP. يوضح توصيف تفاعل البوليميراز المتسلسل الموضح هنا لخط RMCE غير النسيلي تبادل الكاسيت الكامل وأن برنامج الاختيار المستخدم يولد خطوطا عشوائية خالية من التكامل ، لكل من المانح RMCE والمتجه المعبر عن الفليبباز. باختصار ، تعمل طريقة RMCE هذه على تبسيط التحرير الجيني بشكل كبير في hPSCs لموضع محدد مقارنة بالنوكليازات المستهدفة.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في 15 يوما. لذلك ، فإن RMCE هي أداة سريعة جدا لتحرير الجينات تسمح بإجراء دراسات مقارنة في بيئة متساوية الجين. عند استخدام هذا الإجراء ، من المهم أن يكون لديك كفاءات نقل أعلى من 30٪ وتشكيل عامل اختيار التخزين الأساسي المناسب.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية أداء RMCE في موضع AAVS1 لPSCs البشرية وكيفية توصيف خط إعادة التجميع.