الآلي الكمي وتحليل إجراءات الفرز الخلية باستخدام يماغيج الإضافات

الهدف العام من هذا البروتوكول هو استخدام أدوات التحليل الرقمي لإجراء عد دقيق وسريع للخلايا في معلق خلوي أو عند هجرتها في غشاء اختبار الغزو. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول الباحثين في تحديد كمية الخلايا المطلوبة للتقنيات الشائعة واختبارات حركية الخلايا في المختبر. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطريقة في توفير عد دقيق وسريع للخلايا مع إدراج مرشحات وأدوات تحليل متعددة.

للبدء، اضبط إضاءة المجهر على الحد الأقصى. انتقل إلى العدسة الشيئية 4x وتأكد من استخدام مرشحات تباين الطور. ثم، ومن خلال برنامج المجهر، اضبط إعدادات التقاط الصور على قيمها الافتراضية.

الآن، ضع مقياس كريات الدم القياسي (hemocytometer) على منصة المجهر والتقط صورة لخطوة معايرة حجم الصورة. اضبط وقت التعرض حسب الحاجة. في برنامج ImageJ، وضمن حاسبة تركيز الخلايا، افتح الصورة وانقر فوق زر "Get Image Dimension".

يقوم هذا الإجراء بملء مربعات النص الخاصة بعرض الصورة وارتفاعها بدقة الصورة بالبكسل. بعد ذلك، اختر أداة الخط المستقيم وارسم خطاً مستقيماً عبر الطول الكامل للمربع الرئيسي p-square في مقياس خلايا الدم (hemocytometer) عن طريق النقر وسحب المؤشر. ثم، اضغط على مفتاح M لإظهار نافذة النتائج.

الآن، اكتب القيمة الموجودة في عمود الطول في مربع نص "p-square length" في حاسبة تركيز الخلايا. بعد ذلك، انقر فوق زر "Calculate Image Volume" لإخراج حجم الصورة في مربع نص "image volume". وأخيرًا، انقر فوق زر "Save" لإكمال معايرة المكون الإضافي.

لتحليل العينة، يتم تحميل 10 µL من الخلايا في كلتا حجرتي شريحة مقياس كرات الدم (hemocytometer)، وضبط التركيز بحيث يظهر الجزء الداخلي من الخلايا أدكن من غشاء الخلية، وذلك لضمان التركيز ضمن المقطع العرضي المركزي للخلية وليس عند القطبين. بعد ذلك، يتم ضبط التعريض الضوئي بشكل إضافي لضمان عدم التعريض المفرط للخلايا. ومن المقبول أن تكون خطوط مقياس كرات الدم مرئية بشكل طفيف.

الآن، قم بالتقاط من خمس إلى عشر صور غير متداخلة للمنطقة المركزية من مقياس كرات الدم (hemocytometer). يجب أن تكون دقةها وتكبير كل صورة مماثلاً لما كان عليه في صورة معايرة الحجم. بعد ذلك، في حاسبة تركيز الخلايا، انقر فوق "Count Cells" ومن النافذة المنبثقة، اختر المجلد المراد عده.

بعد ذلك، أدخل عدد الصور التي تم التقاطها لكل غرفة في مربع إدخال عدد العينات، ثم انقر فوق موافق. سيقوم الملحق الآن بجمع البيانات. راجع النص لمزيد من التفاصيل. للبدء، قم بضبط إعدادات التقاط الصور في برنامج المجهر على قيمها الافتراضية.

بالنسبة لمنصة المجهر التشريحي، استخدم خلفية بيضاء صلبة ومصدراً ضوئياً فوق المنصة، ويُفضل استخدام مصباحي LED مرنين. الآن، ضع شريحة غشاء اختبار الهجرة المكتملة على المنصة. وبالنظر إلى الصورة المباشرة التي يعرضها البرنامج، قم بضبط التكبير يدوياً بحيث تكون حواف غشاء واحد فقط ضمن مجال رؤية الكاميرا.

بعد ذلك، قم بضبط مواضع مصدر الضوء وأوقات التعرض لإعادة إنتاج الصورة المثالية قدر الإمكان، بحيث يكون لون الخلفية في أدنى مستوياته ويكون الغشاء مضاءً بشكل موحد. وتعتمد دقة عد الخلايا على الحصول على صور عالية الجودة.

لذلك من المهم التقاط أفضل صورة يمكن أن توفرها كاميرا المستخدم لتحقيق الاستخدام الأكثر كفاءة للملحقات البرمجية. الآن، قم بإزالة الشريحة وضبط توازن اللون الأبيض للصورة في برنامج المجهر لإكمال عملية المعايرة. وقبل البدء بالتصوير مباشرة، قم بتسوية كل غشاء عن طريق الضغط على غطاء الشريحة لإزالة أكبر قدر ممكن من الفقاعات المحتبسة.

الآن، حدد موقع مجلد الالتقاط ضمن البرنامج. بعد ذلك، التقط صورة واحدة لكل غشاء، مع حفظ ملفات الصور بتنسيق TIF باستخدام اصطلاح تسمية يبدأ بالعينة 001 مع زيادة الرقم تدريجياً لكل صورة. هذا الاصطلاح في التسمية ضروري لكي يتمكن المكون الإضافي من العثور على الملفات.

إذا كنت ترغب في إجراء تصحيح المجال المسطح (flatfield correction)، فابحث عن منطقة فارغة في كل شريحة والتقط صورة فارغة. احفظ الملف باسم العينة متبوعاً بكلمة "blank". بعد ذلك، افتح المكون الإضافي TC في برنامج ImageJ.

داخل برنامج TC، انقر فوق زر Flatfield، ومن مربع حوار Choose Directory حدد المجلد الذي حُفظت فيه صور الغشاء. الآن، افتح صورة غشاء لاختبار الهجرة واختر Color Threshold. في النافذة، اضبط الطريقة على Shanbhag.

اضبط لون العتبة على اللون الأبيض. واضبط مساحة اللون على RGB وألغِ تحديد خيار الخلفية الداكنة. بعد ذلك، حرك المنزلقات العلوية إلى الصفر والمنزلقات السفلية إلى 255 لجعل الصورة بيضاء بالكامل.

بمجرد أن يظهر اللون الأبيض، قم بضبط منزلقات اللونين الأخضر والأحمر حتى تصبح النوى فقط هي المرئية. وفي المكون الإضافي TC، انسخ قيم منزلقات RGB إلى مربعات النص الخاصة بعتبة RGB في إعدادات التكوين المرتبطة. بعد ذلك، انقر فوق زر Add/Modify وقم بتحديث التكوين.

داخل لوحة إعدادات التكوين، انقر فوق حفظ (Save) لكتابة الإعدادات على القرص الصلب. والآن، لعد الصور باستخدام المكون الإضافي TC، انقر فوق مجلد العد (Count Folder) وحدد المجلد المراد عده. سيقوم البرنامج بعد ذلك بمعالجة الصور وإضافة البيانات تلقائياً إلى الجدول الرئيسي.

الآن، في الجدول الرئيسي، ستظهر علامة اختيار في عمود "المعايرة؟" (Calibrate?) إذا كانت الصورة مُعلّمة للمعايرة بناءً على تشابهها مع المقاييس المثالية. حدد جميع العينات المُعلّمة للمعايرة.

بعد ذلك، انقر بزر الماوس الأيمن واختر Recount and Suggested Size. سيؤدي هذا إلى إعادة عد الصور باستخدام الحد الأدنى المقترح لمساحة الجسيمات. ثم انقر بزر الماوس الأيمن مرة أخرى واختر Show Plot.

ستكون الصورة المثالية ذات رسم بياني يشبه توزيعاً طبيعياً ذا ذيل طويل جهة اليمين. إذا لزم الأمر، قم بضبط نطاق الحجم الأدنى أو إعدادات عتبة RGB من خلال تحديد العينة، والنقر بزر الماوس الأيمن، واختيار Recount and Manual Settings. بعد ذلك، أدخل الإعدادات المطلوبة وانقر فوق Count لإعادة عد الصورة.

لضبط العد يدوياً، حدد العينات، وانقر بزر الفأرة الأيمن على الجدول، ثم اختر Open image with counts. ستفتح الصورة الأصلية مع علامات حمراء تمثل كل جسيم قام الملحق بعدّه. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام خيار Show counted binary image للتحقق من مدى دقة تمييز الخلايا الفردية بواسطة عتبة اللون.

لإضافة عد يدوي، استمر في الضغط على مفتاح control وانقر بزر الماوس الأيسر. سيؤدي ذلك إلى إضافة علامة عند موقع المؤشر والتي تُضاف إلى إجمالي العدد. لإزالة علامة يدويًا، انقر بزر الماوس الأيمن فوق الصورة وسيقوم الملحق بإزالة العلامة الأقرب إلى المؤشر.

لإزالة مجموعة من العلامات، حدد منطقة الاهتمام وانقر بزر الفأرة الأيمن فوق المنطقة مع الاستمرار في الضغط على مفتاح control. تعتمد عملية حاسبة تركيز الخلايا على صورة معايرة p-square وحساب طول p-square والبكسلات. يبلغ حجم p-square في مقياس خلايا الدم (hemocytometer) مقدار 100 nanoliters، وبناءً على هذا الثابت، يمكن حساب الحجم الإجمالي للصورة بعد تحويل البكسلات إلى millimeters.

تظهر مقارنة بين العد اليدوي والآلي عبر 57 صورة من تجارب وأنواع خلايا مختلفة وجود ارتباط وثيق جداً بين كلا الطريقتين. وقد تم عد تركيزات تتراوح بين خمسة ملايين و 2,000 خلية لكل ملليلتر بدقة باستخدام العملية الآلية. يمثل المقياس Q الوضوح العام للصور بناءً على توزيع أحجام الجسيمات المتميزة.

تكون قيمة Q كافية عندما تكون أكبر من 0.5. وبتطبيق هذه المعايير على مجموعة مختارة من الصور التي تتراوح جودتها من متوسطة إلى ممتازة من حيث السطوع وضوضاء الخلفية، كانت أعداد الصور المعايرة أقرب بكثير إلى الأعداد اليدوية مقارنة بأعداد الصور غير المعايرة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية عد الخلايا بدقة وكفاءة في المعلقات ومن مقايسات حركية الخلايا باستخدام ملحقات CCC وTC في برنامج ImageJ.

بمجرد إتقان ملحق TC، يمكن إجراء عمليات الاستحواذ والقياس الكمي وضبط تعداد الخلايا في أقل من ساعة. يعتمد كلا الملحقين على ميزة عد الجسيمات في برنامج ImageJ، ويمكن تعديلهما عن طريق تحرير وحدات الماكرو التي يستخدمها ImageJ. وهذا يمنح المستخدم مرونة أكبر لتوسيع نطاق استخدام الملحقات لتشمل جسيمات أخرى.