الآلي الكمي وتحليل إجراءات الفرز الخلية باستخدام يماغيج الإضافات

الهدف العام من هذا البروتوكول هو استخدام أدوات التحليل الرقمي لإجراء تعداد دقيق للخلايا بسرعة في حالة تعليق أو عند الهجرة في غشاء فحص الغزو. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول الباحثين في تحديد عدد الخلايا المطلوب للتقنيات الشائعة وفحوصات حركة الخلايا في المختبر. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها توفر عددا سريعا ودقيقا للخلايا مع تضمين العديد من المرشحات وأدوات التحليل.

للبدء ، اضبط إضاءة المجهر على الحد الأقصى. قم بالتبديل إلى هدف 4x وتأكد من استخدام مرشحات تباين الطور. بعد ذلك ، داخل برنامج المجهر ، اضبط إعدادات التقاط الصورة على قيمها الافتراضية.

الآن ضع مقياس كثافة الدم القياسي على مرحلة المجهر والتقط صورة لخطوة معايرة حجم الصورة. اضبط وقت التعرض حسب الحاجة. في ImageJ ، ضمن حاسبة تركيز الخلية ، افتح الصورة وانقر فوق الزر "الحصول على أبعاد الصورة".

يملأ هذا الإجراء مربعي نص عرض الصورة وارتفاعها بدقة الصورة بالبكسل. بعد ذلك ، حدد أداة الخط المستقيم وارسم خطا مستقيما عبر كامل طول المربع p الأساسي لمقياس كثافة الدم عن طريق النقر فوق المؤشر وسحبه. ثم اضغط على المفتاح M لعرض نافذة النتائج.

الآن ، اكتب القيمة من عمود الطول في مربع النص بطول مربع p في حاسبة تركيز الخلية. ثم انقر فوق حساب حجم الصورة زر لإخراج حجم الصورة في مربع نص حجم الصورة. أخيرا ، انقر فوق حفظ زر لإكمال معايرة المكون الإضافي.

لتحليل العينة ، قم بتحميل 10 ميكرولترات من الخلايا في كلتا الغرفتين من شريحة مقياس الدم واضبط التركيز بحيث يكون الجزء الداخلي من الخلايا أغمق من غشاء الخلية لتوفير التركيز داخل المقطع العرضي المركزي للخلية وليس في القطبين. بعد ذلك ، اضبط التعريض الضوئي بشكل أكبر حتى لا يتم تعريض الخلايا بشكل مفرط. خطوط مقياس الدم المرئية قليلا مقبولة.

الآن ، التقط من خمس إلى عشر صور غير متداخلة للمنطقة المركزية من مقياس الدم. يجب أن تكون دقة وتكبير كل صورة هي نفسها التي كانت في صورة معايرة وحدة التخزين. بعد ذلك ، في حاسبة تركيز الخلية ، انقر فوق عدد الخلايا وفي النافذة المنبثقة ، حدد مجلدا ليتم حسابه.

بعد ذلك ، في مربع إدخال رقم العينة ، أدخل عدد الصور الملتقطة لكل غرفة ، وانقر فوق موافق. سيقوم المكون الإضافي الآن بجمع البيانات. انظر النص لمزيد من التفاصيل. للبدء ، داخل برنامج المجهر ، اضبط إعدادات التقاط الصورة على قيمها الافتراضية.

بالنسبة لمرحلة نطاق التشريح ، استخدم خلفية بيضاء صلبة واستخدم مصدر ضوء فوق المسرح ، ويفضل أن يكون مصباحي LED مرنين. الآن ، ضع شريحة غشاء فحص الهجرة المكتملة على المسرح. بالنظر إلى الصورة في الوقت الفعلي التي يعرضها البرنامج ، اضبط التكبير يدويا بحيث تكون حواف غشاء واحد داخل مجال رؤية الكاميرا.

بعد ذلك، اضبط مواضع مصدر الضوء وأوقات التعريض الضوئي لإعادة إنتاج الصورة المثالية، قدر الإمكان. الذي يحتوي على الحد الأدنى من لون الخلفية وغشاء مضاء بشكل موحد. تعتمد دقة عد الخلايا على الحصول على صور عالية الجودة.

لذلك من المهم التقاط أفضل صورة يمكن تحقيقها بواسطة كاميرا المستخدم من أجل الاستخدام الأكثر كفاءة للمكونات الإضافية. الآن ، قم بإزالة الشريحة وتوازن اللون الأبيض للصورة في برنامج المجهر لإكمال المعايرة. قبل التصوير مباشرة ، قم بتسطيح كل غشاء عن طريق الضغط على زلة الغطاء لإزالة أكبر عدد ممكن من الفقاعات المحبوسة.

الآن ، داخل البرنامج ، قم بتعيين موقع مجلد الالتقاط. بعد ذلك، التقط صورة واحدة لكل غشاء، واحفظ ملفات الصور كملفات TIF باستخدام اصطلاح التسمية للعينة 001 مع زيادات تدريجية في عدد كل صورة. اصطلاح التسمية هذا مطلوب للمكون الإضافي للعثور على الملفات.

إذا كان تصحيح المجال المسطح مطلوبا ، فابحث عن منطقة فارغة لكل شريحة والتقط صورة فارغة. احفظ الملف كاسم عينة فارغ. بعد ذلك ، في ImageJ ، افتح المكون الإضافي TC.

ضمن TC ، انقر فوق الزر Flatfield ، ومن مربع الحوار Choose Directory ، حدد المجلد حيث تم حفظ صور الغشاء. الآن ، افتح صورة غشاء فحص الترحيل وحدد عتبة اللون. في النافذة ، اضبط الطريقة على Shanbhag.

اضبط لون العتبة على الأبيض. اضبط مساحة اللون على RGB وقم بإلغاء تحديد خيار الخلفية الداكنة. بعد ذلك ، اضبط أشرطة التمرير العلوية على الصفر والمنزلقات السفلية على 255 لجعل الصورة بيضاء بالكامل.

بمجرد أن تكون بيضاء ، اضبط منزلقي التمرير الأخضر والأحمر حتى تظهر النوى فقط. في المكون الإضافي TC، انسخ قيم أشرطة تمرير RGB إلى مربعات نص عتبة RGB لإعدادات التكوين المقترنة. ثم انقر فوق الزر "إضافة/تعديل" وقم بالكتابة فوق التكوين.

ضمن لوحة إعدادات التكوين، انقر فوق حفظ لكتابة الإعدادات على محرك الأقراص الثابتة. الآن ، لحساب الصور باستخدام المكون الإضافي TC ، انقر فوق Count Folder وحدد المجلد المراد حسابه. سيقوم البرنامج بعد ذلك بمعالجة الصور وإضافة البيانات تلقائيا إلى الجدول الرئيسي.

الآن ، في الجدول الرئيسي ، ستكون هناك علامة اختيار في ملف معايرة؟ يتم وضع علامة على العمود إذا كان في الصورة للمعايرة بناء على تشابهه مع المقاييس المثالية. حدد جميع العينات التي تم وضع علامة عليها للمعايرة.

ثم انقر بزر الماوس الأيمن وحدد إعادة الفرز والحجم المقترح. سيؤدي هذا إلى إعادة فرز الصور بالحد الأدنى المقترح لمساحة الجسيمات. ثم انقر بزر الماوس الأيمن مرة أخرى وحدد إظهار المؤامرة.

سيكون للصورة المثالية رسم بياني يشبه التوزيع الطبيعي الطويل الأيمن. إذا لزم الأمر، اضبط نطاق الحجم المنخفض أو إعدادات عتبة RGB عن طريق تحديد العينة والنقر بزر الماوس الأيمن وتحديد إعادة الجرد والإعدادات اليدوية. ثم أدخل الإعدادات المطلوبة وانقر فوق العد لإعادة سرد الصورة.

لضبط الأعداد يدويا، حدد العينات، وانقر بزر الماوس الأيمن فوق الجدول، وحدد فتح صورة مع العدد. سيتم فتح الصورة الأصلية بعلامات حمراء تمثل كل جسيم يتم حسابه بواسطة المكون الإضافي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام خيار إظهار الصورة الثنائية المحسوبة للتحقق من مدى جودة حل الخلايا الفردية بواسطة عتبة اللون.

لإضافة عدد يدويا، اضغط مع الاستمرار على مفتاح التحكم وانقر بزر الماوس الأيسر. سيؤدي هذا إلى إضافة علامة في موقع المؤشر والتي تتم إضافتها إلى العدد الإجمالي. لإزالة علامة يدويا ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق الصورة وسيقوم المكون الإضافي بإزالة العلامة الأقرب إلى المؤشر.

لإزالة مجموعة من العلامات، حدد منطقة اهتمام وانقر بزر الماوس الأيمن فوق المنطقة مع الضغط باستمرار على مفتاح التحكم. تعتمد عملية حاسبة تركيز الخلية على صورة معايرة p-square وحساب طول مربع p والبكسل. يبلغ حجم المربع p لمقياس كثافة الدم 100 نانولتر ، وبالنظر إلى هذا الثابت ، يمكن حساب الحجم الكلي للصورة بعد تحويل البكسل إلى ملليمترات.

مقارنة بين التعداد اليدوي والآلي لأكثر من 57 صورة من تجارب وأنواع مختلفة من الخلايا ، أن هناك ارتباطا وثيقا للغاية بين كلتا الطريقتين. تم حساب التركيزات بين خمسة ملايين و 2 000 خلية لكل مليلتر بدقة باستخدام العملية الآلية. يمثل المقياس Q وضوح الصور الإجمالي بناء على توزيع أحجام الجسيمات المميزة.

Q كاف أكبر من 0.5. بتطبيق هذه المؤهلات على مجموعة مختارة من الصور المتواضعة إلى الممتازة فيما يتعلق بالسطوع وضوضاء الخلفية ، كانت أعداد الصور المعايرة أقرب بكثير إلى العد اليدوي من عدد الصور غير المعايرة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية حساب الخلايا بدقة وكفاءة في حالة تعليق ومن فحوصات حركة الخلية باستخدام المكونات الإضافية CCC و TC ImageJ.

بمجرد إتقان المكون الإضافي TC ، حيث يمكن إجراء الاستحواذ والقياس الكمي وتعديل عدد الخلايا في أقل من ساعة. يعتمد كلا المكونين الإضافيين على ميزة عد الجسيمات من ImageJ ويمكن تعديلهما عن طريق تحرير وحدات الماكرو التي تستخدمها ImageJ. يوفر هذا مرونة أكبر للمستخدم لتوسيع نطاق المكونات الإضافية لتشمل جزيئات أخرى.