تطوير المستمدة الخلية الجذعية خلايا T التنظيمية مستضد محددة ضد المناعة الذاتية

الهدف العام من هذه التجربة هو تطوير طريقة جديدة لتوليد الخلايا التائية التنظيمية الملتهبة المرتبطة بالمفاصل المشتقة من الخلايا الجذعية للعلاج المناعي ضد التهاب المفاصل المناعي الذاتي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على سؤال رئيسي في مجال المناعة الذاتية حول الالتهابات المناعية المحتملة لالتهاب المفاصل المناعي الذاتي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الخلايا التائية التنظيمية المشتقة من الخلايا الجذعية هي من نوع واحد.

ابدأ بتخفيف الخلايا المغذية ذات الأهمية إلى كثافة لا تقل عن كثافة واحدة في 10 الخلايا الرابعة لكل سنتيمتر مربع في وسط OP9 ، والطلاء مرة واحدة في 10 إلى الخلايا المغذية السادسة لكل طبق 10 سنتيمترات. عندما تصبح الخلايا ملتقية بنسبة 80 إلى 90٪ ، قم بإزالة الوسط من المزارع والبذور 0.5 إلى مرة واحدة في 10 إلى الخلايا الجذعية متعددة القدرات المحفزة المنقولة بالفيروسات القهقرية أو IPSCs في وسط OP9 في كل طبق. بعد خمسة أيام ، استنشق الوسط واغسل الخلايا ب 10 ملليلتر من PBS.

ثم افصل الخلايا بأربعة ملليلتر من التربسين لكل طبق ، عند 37 درجة مئوية. بعد 10 دقائق ، أوقف التفاعلات بثمانية ملليلتر من وسط IPSC واسحب الخلايا للطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من وسط IPSC الطازج وأعد طلاء الخلايا على أطباق جديدة بحجم 10 سم.

اسمح للخلايا المغذية بالالتصاق باللوحة لمدة 30 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا. بعد ذلك ، اجمع IPSCs العائمة وقم بتصفية الخلايا المنقولة من خلال مصفاة 70 ميكرون للعد. قم بالبذور خمسة في 10 إلى الخامس IPSCs على صفيحة ملتقرة جديدة من 80 إلى 90٪ من الخلايا المغذية في وسط OP9 مكملة ب Murine-Flt3-Ligand وإعادة المزارع إلى الحاضنة.

بعد ثلاثة أيام ، استخدم ماصة سعة 10 مليلتر لغسل الطبق بوسط الاستزراع. بعد ذلك ، أضف خمسة ملليلتر من وسط OP9 الطازج إلى الطبق واغسل برفق أي IPSCs شبه ملتصقة بسحب دقيق وقوي لا يعطل طبقة الخلية المغذية. كرر الغسيل مع 10 مل من PBS لحصاد آخر الخلايا شبه الملتصقة ، واسحب الغسالات من كل طبق إلى أنبوب مخروطي واحد لكل ثقافة.

بعد تدوير الخلايا ، أعد تعليق الكريات في 10 مل من وسط OP9 المكملة ب Murine-Flt3-Ligand و IL-7 وقم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة 70 ميكرون. قم بزرع مزرعة IPSC واحدة لكل بئر في صفيحة استزراع من ستة آبار تحتوي على طبقات أحادية أحادية للخلايا المغذية المتقاربة بنسبة 80 إلى 90٪ وإعادة المزارع المشتركة إلى الحاضنة. كل يومين ، استبدل نصف الوسط بوسط OP9 الطازج المكمل ب Murine-Flt3-Ligand و IL-7 ، وكل أربعة إلى ستة أيام ، أعد زرع IPSCs المتمايزة على ألواح جديدة بطبقة جديدة من الخلايا المغذية حسب الضرورة.

ابدأ بفصل الثقافات الخلوية ذات الأهمية باستخدام التربسين وإعادة تعليق كل نوع من الخلايا في 10 ملليلتر من الوسط الطازج. ضع كل مزرعة خلية في طبق جديد يبلغ طوله 10 سم واسمح للخلايا المغذية بالالتصاق في حاضنة زراعة الخلايا. بعد 30 دقيقة ، اجمع IPSCs العائمة وقم بتمرير الثقافات عبر مصافي خلايا فردية 70 ميكرون لإزالة مجموعات الخلايا للعد.

أعد تعليق كل مزرعة عند 1.5 في 10 إلى الخلايا السابعة لكل تركيز مليلتر في PBS البارد ، مع التصفية مرة أخرى حسب الضرورة. بعد ذلك ، ضع فئران C57BL / 6 من أربعة إلى ستة أسابيع واحدة تلو الأخرى في مصفاة صغيرة وانقل 200 ميكرولتر من نوع واحد من الخلايا لكل فأر إلى وريد الذيل لكل. استخدم فرجار مقياس الاتصال الهاتفي لقياس تورم كلتا الركبتين لتحديد القياس الأساسي.

بعد 10 أيام من نقل الخلية ، استخدم حقنة سعة مليلتر واحد لحقن الفئران ب 100 ميكروغرام من BSA الميثيلي المستحلب في مساعد فرويند الكامل عند قاعدة ذيل كل تجريبي. بعد 17 يوما من نقل الخلية ، قم بتحفيز التهاب المفاصل عن طريق الحقن داخل المفصل ل 20 ميكروغرام من BSA الميثيلي في 10 ميكرولتر من PBS في مفصل الركبة اليسرى و 20 ميكروغرام من BSA الميثيلي و 100 ميكروغرام من البيضا الكامل في 10 ميكرولتر من PBS في مفصل الركبة الأيمن لكل مخدر يتم نقله بالتبني. بعد سبعة أيام من إحداث التهاب المفاصل ، قم بقياس الركبتين مرة أخرى لحساب النسبة المئوية للزيادة في قطر الركبة ، واستئصال الرضفة جراحيا.

إصلاح المفاصل في الفورمالين. ثم ، بعد إزالة الكلس في EDTA ، قم بتضمين الركبتين في البارافين واحصل على أربعة أقسام ميكرون للتلوين والتحليل الكيميائي النسيجي. في اليوم 28 ، تعبر الخلايا التنظيمية التائية الخاصة بالمستضد عن مستويات كبيرة من CD3 ومستقبلات الخلايا التائية الخاصة بالمستضد.

تعبر معظم هذه الخلايا أيضا عن CD25 و CD127 و CTLA-4 ، وكلها يتم التعبير عنها عادة بمستويات مرتفعة في الخلايا التنظيمية التائية التي تحدث بشكل طبيعي. في الواقع ، يستمر FoxP3 في الخلايا التنظيمية T المشتقة من IPSC ، حتى بعد التحفيز المختبري طويل الأمد باستخدام Notch ligand ، كما تم اكتشافه عن طريق التلوين داخل الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، تنتج هذه الخلايا التنظيمية IPSC T الخاصة بالمستضد السيتوكينات القمعية عند تحفيزها بخلايا الطحال النبضية المستضد في المختبر ، مما يشير إلى نمط ظاهري قمعي محتمل لهذه الخلايا.

لوحظت الخلايا الإيجابية ل FoxP3 في الركبتين المعالجة ب OVA مع عدم وجود خلايا إيجابية ل FoxP3 تظهر في الركبتين التي تتلقى IPSCs المنقولة ناقلات التحكم. علاوة على ذلك ، يتم تصور العديد من الخلايا الإيجابية CD4 ، FoxP3 الإيجابية ، TCR3 Beta 5 الإيجابية في ركبتي الفئران التي تتلقى IPSCs المنقولة بناقل TCR-FoxP3 ، مقارنة بناقل FoxP3 وحده ، مما يشير إلى أن خلايا IPSC-Treg الخاصة بالمستضد تهاجر إلى ركبة التهاب المفاصل التي يسببها المستضد بعد نقلها بالتبني إلى المتلقية. يؤثر نقل الخلايا بالتبني المشتق من IPSC أيضا على انخفاض كبير في تورم الركبة الالتهابي عند وجود OVA ، ولكن ليس له أي تأثير على التحكم في الركبتين المحقونة بميثيل BSA.

يتم إثبات الآثار الإيجابية لتقليل التورم من خلال التصوير المتوافق مع Micro-CT عالي الدقة لفقدان العظام المنخفض الذي لوحظ في الركبتين المعالجة بنقل الخلايا مقارنة بالحيوانات المحقونة MBSA فقط. بمجرد حشدها ، يمكن أن تكتمل هذه الإجراءات المتعمقة في غضون ستة أسابيع إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذه التقنية ، من المهم أن تتذكر إحداث التمايز المشبع لمستضد TCR-FoxP3 IPSCs المنقولة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن أيضا مناقشة مركبات مختلفة من السيتوكينات المثبطة للإجابة على أسئلة إضافية حول بقاء وجودة الخلايا التائية الخاصة بالمستضد. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العلاج القائم على الخلايا لاستكشاف دور الخلايا التائية التنظيمية الخاصة بالمستضد في أمراض المناعة الذاتية. لا تنس أن العمل مع مفاعلات الهيكل الآلي المباشرة يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأن الاحتياطات ، مثل العمل في منشأة أساسية ، يجب دائما اتخاذ أثناء إجراء الإجراء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجربتك.