تطوير المستمدة الخلية الجذعية خلايا T التنظيمية مستضد محددة ضد المناعة الذاتية

الهدف العام من هذه التجربة هو تطوير طريقة جديدة لتوليد خلايا تائية تنظيمية مرتبطة بالمفاصل الملتهبة ومشتقة من الخلايا الجذعية لاستخدامها في العلاج المناعي ضد التهاب المفاصل المناعي الذاتي. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال المناعة الذاتية حول العلاجات المناعية المحتملة لالتهاب المفاصل المناعي الذاتي. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن الخلايا التائية التنظيمية المشتقة من الخلايا الجذعية تكون محددة النوع ومن نوع واحد.

ابدأ بتخفيف الخلايا المغذية المطلوبة إلى كثافة لا تقل عن 1×10⁴ خلية لكل سنتيمتر مربع في وسط OP9، ثم ازرع 1×10⁶ من الخلايا المغذية في طبق قطر 10 سنتيمتر. عندما تصل الخلايا إلى درجة تلاقي تتراوح بين 80 إلى 90%، قم بإزالة الوسط من المزارع وازرع من 0.5 إلى 1×10⁵ من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) المحولة فيروسياً والقابلة للتحفيز في وسط OP9 في كل طبق. بعد خمسة أيام، قم بشفط الوسط وغسل الخلايا باستخدام 10 milliliters من PBS.

بعد ذلك، قم بفصل الخلايا باستخدام أربعة ملليلتر من Trypsin لكل طبق، عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. وبعد مرور 10 دقائق، أوقف التفاعلات بإضافة ثمانية ملليلتر من وسط iPSC ثم اسحب الخلايا لإجراء عملية الطرد المركزي. أعد تعليق الراسب في 10 ملليلتر من وسط iPSC جديد وأعد زرع الخلايا في أطباق جديدة بقطر 10 سنتيمتر.

اترك الخلايا المغذية تلتصق بالطبق لمدة 30 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا. بعد ذلك، قم بجمع الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات (iPSCs) العائمة وقم بترشيح الخلايا التي تم نقل الجينات إليها عبر مصفاة بقطر 70 micron لغرض العد. ازرع 5 × 10⁵ من الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات (iPSCs) على طبق جديد من الخلايا المغذية وصل مستوى تلاحمه إلى 80 إلى 90% في وسط OP9 مضاف إليه Murine-Flt3-Ligand، ثم أعد المزارع إلى الحاضنة.

بعد مرور ثلاثة أيام، استخدم ماصة سعة 10 milliliter لغسل الطبق باستخدام الوسط الزرعي. ثم أضف خمسة milliliters من وسط OP9 الطازج إلى الطبق، وقم بغسل أي خلايا IPSCs شبه ملتصقة بلطف عن طريق السحب والضخ القوي والحذر بالماصة بحيث لا يتم تعطيل طبقة الخلايا المغذية. كرر عملية الغسل باستخدام 10 milliliters من PBS لحصد ما تبقى من الخلايا شبه الملتصقة، مع سحب سوائل الغسل من كل طبق وجمعها في أنبوب مخروطي واحد لكل مزرعة.

بعد تدوير الخلايا لترسيبها، أعد تعليق الكتل المترسبة في 10 milliliters من وسط OP9 المدعم بـ Murine-Flt3-Ligand و IL-7، ثم قم بتصفية الخلايا عبر مصفاة بمسام 70 micron. ازرع مستنبت واحد من IPSC في كل بئر من أطباق زراعة سداسية الآبار تحتوي على طبقات أحادية من الخلايا المغذية وصلت نسبة تلاحمها إلى 80 إلى 90%، وأعد المستنبتات المشتركة إلى الحاضنة. كل يومين، استبدل نصف الوسط بوسط OP9 جديد مدعم بـ Murine-Flt3-Ligand و IL-7، وكل أربعة إلى ستة أيام، أعد زراعة IPSCs المتمايزة في أطباق جديدة تحتوي على طبقة حديثة من الخلايا المغذية حسب الضرورة.

ابدأ بفصل المزارع الخلوية المطلوبة باستخدام Trypsin وإعادة تعليق كل نوع من الخلايا في 10 milliliters من وسط غذائي طازج. ازرع كل مزرعة خلوية في طبق جديد بقطر 10 centimeter واترك الخلايا المغذية تلتصق داخل حاضنة المزارع الخلوية. بعد 30 minutes، اجمع خلايا IPSCs العائمة ومرر المزارع عبر مصفاة خلايا فردية بمسامية 70 micron لإزالة التكتلات الخلوية من أجل عملية العد.

أعد تعليق كل مستنبت بتركيز 1.5 × 10⁷ خلية/مل في محلول PBS بارد، مع الترشيح مرة أخرى عند الضرورة. ثم ضع الفئران الإناث من سلالة C57BL/6 التي تتراوح أعمارها بين أربعة إلى ستة أسابيع، واحدة تلو الأخرى، في جهاز تثبيت الحيوانات الصغيرة، وانقل تكييفياً 200 µL من نوع واحد من الخلايا لكل فأرة عن طريق الوريد الذيلي لكل حيوان. استخدم فرنية قياس ذات قرص قياس لقياس تورم الركبتين لتحديد القياس المرجعي.

بعد مرور 10 أيام على نقل الخلايا، استخدم حقنة سعة 1 ملليلتر لحقن الفئران بـ 100 ميكروجرام من BSA الميثيلي المستحلب في مساعد فروند الكامل في قاعدة ذيل كل حيوان تجريبي. وبعد 17 يوماً من نقل الخلايا، يتم تحفيز التهاب المفاصل عن طريق الحقن داخل المفصل لـ 20 ميكروجرام من BSA الميثيلي في 10 ميكرولتر من PBS في مفصل الركبة اليسرى، و20 ميكروجرام من BSA الميثيلي و100 ميكروجرام من أوفالبومين الكامل في 10 ميكرولتر من PBS في مفصل الركبة اليمنى لكل حيوان مخدر خضع للنقل التكيفي. وبعد سبعة أيام من تحفيز التهاب المفاصل، قم بقياس الركبتين مرة أخرى لحساب النسبة المئوية للزيادة في قطر الركبة، ثم قم باستئصال الرضفات جراحياً.

قم بتثبيت المفاصل في الفورمالين. بعد ذلك، وبعد إزالة الكالسيوم باستخدام EDTA، يتم تضمين الركبتين في البارافين والحصول على مقاطع بسمك أربعة ميكرون من أجل الصبغ الكيميائي النسيجي والتحليل. وفي اليوم 28، تعبر الخلايا التائية التنظيمية النوعية للمستضد عن مستويات كبيرة من CD3 ومستقبلات الخلايا التائية النوعية للمستضد.

تُعبّر معظم هذه الخلايا أيضاً عن CD25 وCD127 وCTLA-4، وهي جميعاً تُعبّر عادةً بمستويات مرتفعة في الخلايا التائية المنظمة الموجودة طبيعياً. وبالفعل، يستمر وجود FoxP3 في الخلايا التائية المنظمة المشتقة من IPSC، حتى بعد التحفيز طويل الأمد في المختبر باستخدام ربيطة Notch، كما تم الكشف عن ذلك بواسطة الصبغ داخل الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، تنتج هذه الخلايا التائية المنظمة المشتقة من IPSC والمحددة لمستضد معين سيتوكينات مثبطة عند تحفيزها في المختبر بخلايا طحالية محملة بالمستضد، مما يشير إلى نمط ظاهري مثبط محتمل لهذه الخلايا.

تُلاحظ وجود خلايا موجبة لـ FoxP3 في الركب المعالجة بـ OVA، بينما لا تظهر أي خلايا موجبة لـ FoxP3 في الركب التي تلقت خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات (iPSCs) محولة بواسطة ناقل تحكم. وعلاوة على ذلك، يُلاحظ وجود عدد أكبر بكثير من الخلايا الموجبة لـ CD4 وFoxP3 وTCR3 Beta 5 في ركب الفئران التي تلقت iPSCs محولة بواسطة ناقل TCR-FoxP3 مقارنة بتلك التي تلقت ناقل FoxP3 وحده، مما يشير إلى أن خلايا iPSC-Treg النوعية للمستضد تهاجر إلى الركبة المصابة بالتهاب المفاصل المستحث بالمستضد بعد نقلها التبني إلى الحيوانات المستقبلة. كما يؤدي النقل التبني للخلايا المشتقة من iPSC إلى انخفاض ملموس في تورم الركبة الالتهابي عند وجود OVA، ولكن لا يوجد له أي تأثير على الركب المحقونة بـ BSA الميثيلية الضابطة.

تتأكد التأثيرات الإيجابية للحد من التورم بشكل أكبر من خلال تصوير الأشعة المقطعية الدقيقة (Micro-CT) عالية الدقة، والتي أظهرت انخفاضاً في فقدان العظام في الركب المعالجة بنقل الخلايا مقارنة بالحيوانات التي حُقنت بـ MBSA فقط كمجموعة ضابطة. وبمجرد إتقان هذه الإجراءات التفصيلية، يمكن إكمالها في غضون ستة أسابيع إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذه التقنية، من المهم تذكر تحفيز التمايز الموجه لخلايا IPSCs المنقولة جينياً بمستضد TCR-FoxP3.

باتباع هذا الإجراء، يمكن أيضاً دراسة مركبات مختلفة من السيتوكينات المثبطة للإجابة على أسئلة إضافية حول بقاء وجودة خلايا T reg المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) والنوعية للمستضد. وبعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العلاج القائم على الخلايا لاستكشاف دور الخلايا التائية التنظيمية النوعية للمستضد في الأمراض المناعية الذاتية. لا تنسَ أن العمل مع البكتيريا ذات الأجسام المضادة المباشرة يمكن أن يكون خطيراً للغاية، وأنه يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات، مثل العمل في مرفق أساسي ثنائي المستوى، أثناء تنفيذ الإجراء.

شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجربتكم.