الكشف عن آخر الغدد الصماء في المياه عن طريق المتاحة تجاريا في المختبر Transactivation اختبارات بيولوجية

الهدف العام من هذا الإجراء الموحد هو فحص عينات المياه بحثا عن المواد الكيميائية النشطة في الغدد الصماء ، باستخدام فحوصات الخلايا القائمة على المستقبلات المتاحة تجاريا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال مراقبة جودة المياه ، مثل ، هل المواد الكيميائية النشطة للغدد الصماء موجودة بالفعل في العينة؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تحلل مجموعة من المركبات النشطة للغدد الصماء بشكل أسرع بكثير من الطرق الكيميائية الحالية.

يمكن أن تساعد هذه التقنية في تشخيص مشكلات جودة المياه التي تنشأ عن وجود مواد كيميائية مسببة لاضطراب الغدد الصماء. توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للملوثات في الماء ، ولكن يمكن تطبيقها أيضا على المصفوفات البيئية الأخرى ، مثل الرواسب والأنسجة. بشكل عام، قد يعاني الأفراد الجدد في هذه التقنية، لأنها تتطلب دقة عالية عند استخدام تقنيات سحب العينات.

لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد عينة الماء في محاليل مخزون من وسيط محدد للفحص ومادة كيميائية مرجعية ، كما هو مفصل في بروتوكول النص. قم بتخزين الوسط الخاص بالفحص عند أربع درجات مئوية للتخزين طويل الأجل. بعد ذلك ، أضف 15 ميكرولترا من المخزون الكيميائي المرجعي المناسب إلى 285 ميكرولترا من وسط الفحص في أنبوب معقم.

امزج العينة عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل. ثم أضف 200 ميكرولتر من 5٪ DMSO في وسط الفحص إلى ثمانية أنابيب إضافية. انقل كمية 100 ميكرولتر من الأنبوب الأول إلى الأنبوب الثاني ، لبدء سلسلة تخفيف ثلاثية الأضعاف.

امزج العينة المخففة في الأنبوب الثاني جيدا باستخدام ماصة. بعد ذلك ، انقل كمية 100 ميكرولتر من الأنبوب الثاني إلى الأنبوب الثالث. استمر في هذه العملية لكل أنبوب.

بعد ذلك ، قم بإعداد عينة تحكم في المذيبات عن طريق خلط 10 ميكرولتر من DMSO في 190 ميكرولتر من وسط الفحص. بعد ذلك ، اجمع وقم بتسمية أربعة أنابيب جديدة. أضف 95 ميكرولترا من وسط الفحص إلى الأنبوب الأول.

ثم أضف خمسة ميكرولترات من مستخلص الماء واخلطها جيدا. أضف 50 ميكرولترا من 5٪ DMSO في وسط الفحص إلى الأنابيب الثلاثة الأخرى. بعد ذلك ، قم بإجراء تخفيف مزدوج عن طريق نقل 50 ميكرولترا من المحلول من أنبوب إلى آخر.

ابدأ بإخراج قارورة من الخلايا المحتجزة بقسم ER أو GR من الفريزر المبرد. قم بإذابة الخلايا بسرعة عن طريق وضع القارورة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية ، مع تحريك لطيف لمدة دقيقتين. ثم قم بتطهير القارورة بنسبة 70٪ من الإيثانول.

ضعه في خزانة السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية. افتح القارورة باستخدام تقنيات معقمة وانقل الخلايا إلى 10 ملليلتر من وسط الفحص. جهاز طرد مركزي عند 200 مرة جم لمدة خمس دقائق.

عند اكتمال الطرد المركزي، استخدم ماصة زجاجية معقمة لشفط المادة الطافية. ثم, أعد تعليق حبيبات الخلية في ستة مليليات من وسط الفحص. امزج خمسة ميكرولترات من تعليق الخلية مع خمسة ميكرولترات من محلول البقع الحيوي.

ثم أضف حصة إلى غرفة العد. احسب عدد الخلايا الحية باستخدام مجهر ضوئي أو عداد خلايا آلي. ثم قم بتقدير كثافة الخلايا الحية في معلق الخلية.

تمييع إذا لزم الأمر ، للحصول على كثافة نهائية تبلغ 550،000 خلية حية لكل مليلتر من وسط الفحص. ابدأ بإنشاء تخطيط لوحة يتضمن منحنى معايرة محدد لفحص تسع نقاط ، وعينات ضمان الجودة / مراقبة الجودة ، وتخفيفات متعددة لكل مستخلص مياه. أضف 90 ميكرولترا من وسط الفحص إلى آبار التحكم الحرة للخلايا المكررة.

صب معلق الخلية في خزان ماصة معقم. ثم ، باستخدام ماصة متعددة القنوات ، أضف 90 ميكرولترا من تعليق الخلية إلى الآبار الأخرى. أضف 10 ميكرولتر من العينات المخففة إلى الآبار المناسبة.

غطي الطبق بغطاء. ثم ضع الطبق في حاضنة 5٪ C02 عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. بمجرد اكتمال الحضانة ، اترك اللوحة تتوازن مع درجة حرارة الغرفة.

ثم يجب إجراء الخطوات التالية في حالة عدم وجود ضوء مباشر. قم بإعداد محلول تحميل ستة × وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم أضف 20 ميكرولترا من محلول التحميل إلى كل بئر.

أضف 10 ميكرولترات من كاشف صلاحية الخلية إلى كل بئر ، لتقييم السمية الخلوية لمستخلص الماء المخفف. ختم اللوحة بغشاء لاصق من الألومنيوم. ثم احتضن الطبق في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

بمجرد اكتمال الحضانة ، أضف اللوحة إلى قارئ اللوحة الدقيقة مع إمكانيات القراءة السفلية. قم بقياس التألق وتحليل البيانات كما هو مفصل في بروتوكول النص. في هذه الدراسة ، تم تحليل أربع عينات مركبة على مدار 24 ساعة من نفايات مياه الصرف الصحي البلدية المعالجة ، وست عينات من المياه السطحية من أنظمة المياه العذبة في جنوب كاليفورنيا ، وحقل فارغ يتكون من مياه فائقة النقاء.

تم الكشف عن نشاط ER في سبع من عينات المياه التمثيلية البالغ عددها 10 عينات، بينما تم الكشف عن نشاط الموارد الوراثية في أربعة. يمكن الاطلاع على إرشادات أداء ضمان الجودة / مراقبة الجودة لمقايسات مستقبلات هرمون الاستروجين ومستقبلات الجلوكوكورتيكويد هنا. تقع نتائج الدراسة للسمية الخلوية ودقة العينة ضمن معايير القبول ، مما يتحقق من قياسات عينة الماء.

تم العثور على أعلى تركيزات مكافئة للمقايسة الحيوية في النفايات السائلة الثانوية ، في حين وجد أن نشاط الموارد الوراثية للنفايات السائلة الثلاثية أقل من حد الفحص الحيوي للكشف. وبالمثل، لم تظهر معظم عينات المياه السطحية أي نشاط للموارد الوراثية يتجاوز حد الكشف، وكانت لها مستويات أقل بكثير من نشاط الموارد الوراثية مقارنة بالنفايات السائلة الثانوية. أظهرت غالبية عينات النفايات السائلة لمحطة معالجة مياه الصرف الصحي استجابة جرعة أعلى من حد الكشف لكل من المقايسات الحيوية للكهرباء والموارد الوراثية.

يمكن رؤية النتائج التمثيلية لمتوسط نسبة التألق الأزرق / الأخضر لهذه العينات ، المرسومة مقابل عامل التخصيب النسبي ، هنا. يمكن إجراء هذه التقنية في غضون 24 ساعة ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء المحاولة ، من المهم اتباع جميع إرشادات ضمان الجودة / مراقبة الجودة.

مهدت هذه التقنية الطريق للمديرين لاستكشاف طرق بديلة لمراقبة المواد الكيميائية المسببة لاضطراب الغدد الصماء في الماء. لا تنس أن العمل مع أزيد الصوديوم يمكن أن يكون خطيرا. يجب اتخاذ الاحتياطات ، مثل العمل في غطاء دخان يعمل بشكل صحيح.