والإسفار الفحص بسيطة لالكمي من الكلاب خارج الخلية العدلات فخ الإصدار

الهدف العام من هذه التجربة هو عزل العدلات الهادئة وقياس إطلاق الحمض النووي استجابة لناهضات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم المناعة والطب البيطري مثل ، ما هي استجابة العدلات لناهضات مختلفة لتحريض المصيدة خارج الخلية للعدلات أو موت الخلايا؟ الميزة الرئيسية لهذا التقني هي أنه يسمح بالفحص السريع لمختلف ناهضات ومثبطات تكوين مصيدة العدلات خارج الخلية.

ابدأ بإدخال إبرة فراشة عيار 21 في الوريد الرأسي لمتبرع سليم من ثم قم بإرفاق حقنة سعة ثلاثة ملليلتر واحصل على ثلاث عينات دم من ثلاثة ملليلتر ، ونقل العينات على الفور إلى أنابيب دم غير مغطاة تحتوي على EDTA. احرص على أن يكون بزل الوريد غير مؤلم وأن تدفق الدم جيد ، لأن سحب الدم السيئ سيؤدي إلى ضعف إنتاج العدلات. بعد ملء كل أنبوب ، اقلب الأنابيب لضمان خلط مناسب للدم ومضاد للتخثر.

تجمع الدم في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا. امزج العينات بحجم متساو من درجة حرارة الغرفة المعقمة 3٪ Dextran 500 عن طريق انعكاس لطيف واترك الأنبوب في وضع مستقيم لمدة 18 إلى 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم انقل الطبقة العليا بلون القش إلى أنبوب جديد حتى يتعذر جمعها دون تلوث بالطبقة الحمراء السفلية.

الطرد المركزي الطبقة العليا. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات يدويا في 10 ملليلتر من PBS المعقم بدرجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف 10 ملليلتر من عديد السكروز بدرجة حرارة الغرفة في محلول فصل خلايا دياتريزوات الصوديوم إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا.

ضع طبقة من الخلايا بعناية فوق محلول الفصل. افصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي. تخلص من الطبقات الثلاث العلوية من خلايا البلازما والصفائح الدموية وحيدة النواة والكثافة.

قم بتحلل أي من كريات الدم الحمراء المتبقية ب 10 مل من الماء بدرجة حرارة الغرفة. بعد 30 ثانية ، أضف 10 مل من كلوريد الصوديوم المعقم بدرجة حرارة الغرفة 1.8٪ لاستعادة التوتر. امزج الخلايا عن طريق الانعكاس اللطيف.

الآن اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات البيضاء برفق في 10 مل من PBS المعقمة. بعد العد ، قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى وأعد تعليق الحبيبات عند خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا السادسة لكل تركيز مليلتر في PBS المعقم بدرجة حرارة الغرفة.

حسب الاقتضاء ، قم بتجفيف كمية صغيرة من الخلايا بالهواء على شريحة زجاجية ، متبوعا بالتلوين باستخدام مجموعة تثبيت وتلوين سريعة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. إذا نجح عزل العدلات ، فيجب أن يكون 95٪ على الأقل من الخلايا المنواة عبارة عن خلايا حبيبية مع الحد الأدنى من تلوث كريات الدم الحمراء كما لوحظ في الفحص المجهري الضوئي. مباشرة بعد عزل العدلات ، قم بتمرير معلق الخلية عبر مرشح معقم معقم 70 ميكرون وأضف خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الرابعة إلى آبار الاختبار للوحة مكونة من 96 بئرا تحتوي على وسائط مزرعة لمدة 30 دقيقة عند 39 درجة مئوية و 4٪ ثاني أكسيد الكربون.

عندما تلتصق الخلايا ، أضف ما يصل إلى حجم نهائي من 100-200 ميكرولتر من ناهض الفائدة في RPMI بدون أحمر الفينول واستكمل ب FCS معطل بالحرارة إلى آبار الاختبار ، وكذلك إلى بئرين فارغين يحتويان على PBS وحده. ثم أضف صبغة حمض نووي مناسبة غير منفذة للخلايا إلى الخلايا وأعد اللوحة إلى الحاضنة. بعد فترة الحضانة المناسبة ، قم بقياس التألق على قارئ صفيحة دقيقة.

التحفيز لمدة ساعة واحدة لعدلات بعامل تنشيط الصفائح الدموية إلى زيادة متوسطة بمقدار أربعة أضعاف في التألق مقارنة بالخلايا غير المحفزة للتحكم ومع ذلك ، فإن PMA هو ناهض أبطأ لا يظهر زيادة تألق العدلات قبل ساعتين من التنشيط ، ولكنه ينتج في النهاية زيادة مماثلة في الطية بمرور الوقت. مضان صبغة الحمض النووي ليس خاصا بتكوين مصيدة خارج الخلية للعدلات ، حيث سيحدث أيضا إذا كان هناك موت للخلايا بواسطة آليات أخرى أو إذا كانت الكواشف ملوثة بالحمض النووي.

على سبيل المثال ، في هذه التجربة التمثيلية ، أنتج مستحضر LPS التجاري مضان عالي جدا في غياب العدلات ، ويفترض أن يكون ذلك بسبب التلوث بالحمض النووي البكتيري. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون ست ساعات تقريبا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التعامل مع العدلات برفق.

لا تقم بتدوير الخلايا ، وقم بإخراج الماصة بدلا من سكب المواد الطافية باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل الفحص المجهري المناعي الفلوري ، للتأكد من أن الحمض النووي الذي تم إطلاقه يرتبط ب NETosis. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أمراض الدم لاستكشاف تفاعل الحمض النووي المنبعث على التخثر وتأثير ناهضات NET الجديدة بما في ذلك بلازما المريض.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل عدلات وقياس استجابتها للناضات.