والإسفار الفحص بسيطة لالكمي من الكلاب خارج الخلية العدلات فخ الإصدار

الهدف العام من هذه التجربة هو عزل الخلايا المتعادلة الساكنة وقياس تحرر الحمض النووي (DNA) منها استجابةً للمنشطات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في علم المناعة والطب البيطري، مثل: ما هي استجابة الخلايا المتعادلة لمختلف منشطات تحفيز المصائد خارج الخلوية للمتعادلات أو موت الخلايا؟ وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح بالفحص السريع لمختلف المنشطات والمثبطات لتكوين المصائد خارج الخلوية للمتعادلات.

ابدأ بإدخال إبرة فراشة عيار 21 في الوريد الرأسي لكلب مانح سليم، ثم قم بتوصيل محقنة سعة 3 mL واجمع ثلاث عينات دم سعة 3 mL لكل منها، مع نقل العينات فوراً إلى أنابيب دم غير مغطاة تحتوي على EDTA. احرص على أن يكون سحب الدم غير صدمي وأن يكون تدفق الدم جيداً، لأن السحب الضعيف للدم سيؤدي إلى إنتاجية منخفضة للخلايا المتعادلة. بعد ملء كل أنبوبة، اقلب الأنابيب لضمان الخلط الكافي للدم ومضاد التخثر.

اجمع الدم في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر. اخلط العينات مع حجم مساوٍ من Dextran 500 بتركيز 3% معقم وفي درجة حرارة الغرفة عن طريق القلب اللطيف، واترك الأنبوب في وضع عمودي لمدة 18 إلى 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، انقل الطبقة العليا ذات اللون القشي إلى أنبوب جديد حتى لا يمكن جمع المزيد منها دون تلوث بالطبقة الحمراء السفلية.

قم بطرد الطبقة العليا مركزياً. تخلص من السائل الطافي، ثم أعد تعليق الراسب يدوياً في 10 milliliters من محلول PBS المعقم في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أضف 10 milliliters من محلول فصل الخلايا المكون من البوليسوكروز في دياتريزوات الصوديوم في درجة حرارة الغرفة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliters.

قم بإضافة الخلايا بعناية في طبقات فوق محلول الفصل. افصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي. تخلص من الطبقات الثلاث العليا التي تحتوي على البلازما والخلايا أحادية النواة الصفائحية وطبقة تدرج الكثافة.

قم بتحليل أي من كريات الدم الحمراء المتبقية باستخدام 10 milliliters من الماء في درجة حرارة الغرفة. بعد 30 ثانية، أضف 10 milliliters من كلوريد الصوديوم المعقم بتركيز 1.8% في درجة حرارة الغرفة لاستعادة التوتر الاسموزي. اخلط الخلايا عن طريق القلب اللطيف للأنبوب.

الآن، قم بجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الراسب الأبيض برفق في 10 milliliters من محلول PBS المعقم. بعد إجراء العد، قم بطرد الخلايا مركزياً مرة أخرى وأعد تعليق الراسب بتركيز 5 × 10⁶ خلية لكل milliliter في محلول PBS معقم في درجة حرارة الغرفة.

عند الاقتضاء، يتم تجفيف حجم صغير من الخلايا هوائياً على شريحة زجاجية، يلي ذلك صبغها باستخدام طقم تثبيت وصبغ سريع وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. إذا تمت عملية عزل الخلايا المتعادلة بنجاح، فيجب أن تكون نسبة 95% على الأقل من الخلايا ذات النواة عبارة عن خلايا محببة مع حد أدنى من تلوث كريات الدم الحمراء كما يُلاحظ تحت المجهر الضوئي. مباشرة بعد عزل الخلايا المتعادلة، يتم تمرير معلق الخلايا عبر مرشح معقم بقطر 70-micron، ثم إضافة 5 × 10⁴ من الخلايا إلى آبار الاختبار في لوحة ذات 96 بئراً تحتوي على أوساط زرع، وذلك للحضن لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 39 °C و 4% CO2.

عندما تلتصق الخلايا، أضف المادة المناهضة (agonist) المطلوبة في وسط RPMI الخالي من الفينول الأحمر والمكمل بـ FCS مثبط حرارياً إلى آبار الاختبار، بحيث يصل الحجم النهائي إلى 100-200 ميكرولتر، وكذلك إلى بئرين فارغين يحتويان على PBS فقط. ثم أضف صبغة حمض نووي مناسبة غير نفاذة للخلايا إلى الخلايا وأعد الطبق إلى الحاضنة. بعد فترة التحضين المناسبة، قم بقياس الفلورسنس باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة.

يؤدي تحفيز الخلايا المتعادلة الكلبية باستخدام العامل المنشط للصفائح لمدة ساعة واحدة إلى زيادة متوسطة بمقدار أربعة أضعاف في الفلورة مقارنة بالخلايا الضابطة غير المحفزة. ومع ذلك، يُعد PMA ناهضاً أبطأ، حيث لا يُظهر زيادة في فلورة الخلايا المتعادلة قبل مرور ساعتين من التنشيط، ولكنه يؤدي في النهاية إلى إنتاج زيادة مماثلة في عدد المرات بمرور الوقت. ولا تعد فلورة صبغة الحمض النووي نوعية لتكون المصائد خارج الخلوية للخلايا المتعادلة، لأنها تحدث أيضاً في حالة موت الخلايا بآليات أخرى أو إذا كانت الكواشف ملوثة بـ DNA.

على سبيل المثال، في هذه التجربة النموذجية، أنتج مستحضر LPS تجاري فلورة عالية جداً في غياب الخلايا المتعادلة، ويفترض أن ذلك يعود إلى التلوث بالحمض النووي البكتيري. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون ست ساعات تقريباً إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر التعامل مع الخلايا المتعادلة برفق.

لا تقم برج الخلايا باستخدام جهاز الفورتيكس (vortex)، واستخدم الماصة لسحب السوائل الطافية بدلاً من سكبها. بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل مجهر التألق المناعي، للتأكد من أن الحمض النووي (DNA) المتحرر يرتبط بعملية NETosis. وقد مهدت هذه التقنية، بعد تطويرها، الطريق للباحثين في مجال علم الدم لاستكشاف تأثير الحمض النووي (DNA) المتحرر على التخثر وتأثير محفزات NET الجديدة، بما في ذلك بلازما المرضى.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا المتعادلة لدى الكلاب وقياس استجابتها للمنبهات.