إنتاج بسيطة وفعالة وتنقية ماوس المايلين دبقية قليلة التغصن البروتين السكري لالتجريبية المناعة الذاتية الدراسات التهاب الدماغ

الهدف العام من هذا البروتوكول هو توليد البروتين على أساس المجال خارج الخلية للسيلات قليلة التغصن أو البروتين السكري أو MOG ، والذي يمكن استخدامه للحث على التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي أو EAE. يتيح هذا البروتوكول لأي مختبر صنع بروتين MOG لاستخدامه كمستضد للحث على EAE. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه لا يعتمد على معدات معالجة البروتين المتخصصة ولكن بدلا من ذلك يمكنك استخدام المعدات القياسية الموجودة في أي مختبر مناعة تقريبا.

حسنا ، تم تحسين هذا البروتوكول لبروتين علامة MOG بناء على إصدار الماوس ، ويجب أن يعمل مع أنظمة تعبير بروتين MOG الأخرى التي تتضمن hestate للتنقية. قم بتلقيح خمسة ملليلتر من المرق المعقم بمخزون الجلسرين BL 21 MOG واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة. أضف 500 ميكرولتر من 100 ملليغرام لكل مليلتر أمبيسلين إلى كل من قوارير سعة 500 ملليلتر تحتوي على 500 ملليلتر من LB المعقم. انقل ملليلترا واحدا من المزرعة الليلية إلى كل من قارورتي مرق LB.

احتضان عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة خمس ساعات أو حتى كثافة بصرية تبلغ 0.6. بمجرد الوصول إلى كثافة الخلية المطلوبة ، أضف 0.5 مل من IPTG مولاري واحد إلى كل قارورة ثقافة. احتضن القارورة ، واضبطها على 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة أربع ساعات ثم في درجة حرارة الغرفة و 75 دورة في الدقيقة طوال الليل.

قم بتوزيع الثقافات بالتساوي على زجاجات سعة 250 مليلتر متوافقة مع أجهزة الطرد المركزي عالية السرعة واحتفظ بالزجاجات على الجليد من هذه النقطة فصاعدا. بيليه الخلايا البكتيرية في 22 ، 000 مرة جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق ودمج جميع الكريات البكتيرية في ما مجموعه 30 مل من محلول المحلل.

انقل هذا الحجم إلى حوالي 50 مليلتر من الأنبوب القافي القادر على التمركز بسرعة عالية. ضع هذا الأنبوب في حمام مائي 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. خلال وقت الحضانة ، رج الأنبوب مرتين لإعادة تعليق الخلايا.

بعد الحضانة ، قم بنقل الأنبوب إلى الجليد وصوتنة المحلول عند 20 كيلو هرتز والسعة 70٪ تنبض لمدة ثلاث ثوان وإيقاف التشغيل لمدة ثلاث ثوان لخمس نبضات ، وصوتنة المحلول لست جولات إجمالية من خمس نبضات ، مما يسمح للمحلول بالتبريد في الجليد بين الجولات. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للمحلول عند 24 ، 000 مرة جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، ثم أعد تعليق الحبيبات في 30 مل من المخزن المؤقت A واحتضان المحلول عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات. بعد الحضانة ، قم بصوتنة المحلول على الجليد كما كان من قبل ، ثم أضف 17.2 جراما من غوانيدين حمض الهيدروكلوريك إلى المحلول.

احتضان العينة على الثلج لمدة ساعة واحدة لإذابة بروتين علامة MOG. لشحن راتنج النيكل وموازنته ، اغسل الراتنج أولا بإضافة 40 مل من الماء إلى كل أنبوب يحتوي على راتنج. ضع الأنابيب أفقيا على كرسي هزاز واتركها تتحرك لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

بمجرد الانتهاء ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 4500 مرة جم لمدة ثماني دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية عن طريق سحب العينة لتجنب إزعاج الحبيبات. ثم أضف 40 مل من مخزن الشحن المؤقت إلى كل أنبوب.

انقل الأنابيب إلى كرسي هزاز واتركها تتحرك لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية قبل إجراء التمركز مرة أخرى كما كان من قبل. تخلص من المادة الطافية وأضف 40 مل من المخزن المؤقت B إلى الأنابيب. انقل الأنابيب إلى كرسي هزاز واتركها تتحرك لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية قبل تمركز الأنابيب بالراتنج مرة أخرى.

لتنقية بروتين علامة MOG ، انقل الحجم الكامل للبروتين المذاب إلى الأنبوب الأول الذي يحتوي على راتنج النيكل. بعد الخلط ، ضع الأنبوب أفقيا على هزاز عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد صهر الأنبوب عند 4500 مرة جم لمدة ثماني دقائق عند أربع درجات مئوية ، انقل هذا المادة الطافية إلى الأنبوب الثاني من راتنج النيكل واحتضانها كما كان من قبل.

في غضون ذلك ، أعد تعليق راتنج النيكل في الأنبوب الأول في مخزن مؤقت للتطور 40 مليلتر وضع الأنبوب أفقيا على هزاز عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق قبل الترميز كما كان من قبل. انقل المادة الطافية التي تحتوي على بروتين علامة MOG المشار إليه إلى زجاجة سعة 250 مل تحمل علامة بروتين MOG المنقى. احتفظ بهذه الزجاجة عند أربع درجات مئوية.

مع كل خطوة شطف ، قم بتجميع المادة الطافية الناتجة في هذه الزجاجة. أضف 40 مل من المخزن المؤقت الشريطي إلى النيكل الموجود في الأنبوب الأول وضعه أفقيا على الروك لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. الطرد المركزي للأنبوب ، وتخلص من المادة الطافية وأعد شحن النيكل المرتفع كما كان من قبل.

بمجرد الانتهاء ، تحرك للأمام مع الأنبوب الثاني كما حدث للأنبوب الأول. ما مجموعه أربع جولات من امتصاص البروتين المذاب على راتنج النيكل المشحون والشطف سيستعيد معظم البروتين. قطع ما يقرب من 30 سم من أنابيب غسيل الكلى لجلد الثعبان.

قم بتأمين أحد طرفيه باستخدام مرقئ قفل عن طريق طي نهاية جلد الثعبان أكثر من ثلاث مرات وتثبيت الطرف المطوي باستخدام المرقئ. املأ جلد الثعبان ببروتين علامة MOG المخفف. ثم قم بإزالة أي فقاعات هواء من جلد الثعبان عن طريق إجبارها على الخروج من الطرف المفتوح.

أخيرا ، أغلق الطرف الآخر من الأنبوب باستخدام مرقئ قفل ثان. بعد ذلك ، املأ دلوا كبيرا بلتر واحد من عازلة أسيتات x بأربعة غوانيدين مولار. ضع ما يصل إلى قسمين من أنبوب غسيل الكلى الذي يحتوي على بروتين علامة MOG في الدلو.

باستخدام شريط لاصق ، قم بتثبيت مرقئ الدم على جانب الجرافة لترك مساحة لقضيب التحريك المغناطيسي للدوران دون عوائق في الأسفل. ضع الدلو في غرفة أربع درجات مئوية على لوحة تنورة مغناطيسية وقم بتشغيله بمعدل دوران بطيء. يستغرق غسيل الكلى ثلاثة أيام على الأقل لتقليل كمية الجوانيدين في المخزن المؤقت تدريجيا.

تحقق بانتظام للتأكد من أن الأنبوب يبدأ سليما وأن الأطراف مغلقة بإحكام. بعد أربع إلى خمس ساعات ، أضف لترا واحدا من محلول أسيتات واحد إلى دلو غسيل الكلى. كرر هذه العملية كل أربع إلى خمس ساعات ليصبح المجموع ثلاث مرات لينتج عنه إجمالي أربعة لترات في الدلو.

بعد التخلص من نصف المخزن المؤقت في الجرافة ، أعد التعبئة بلتر واحد من عازلة أسيتات x وقم بإعداد الأنبوب وشريط التقليب. أخيرا ، استبدل الحجم الأربعة لترات بالكامل في الدلو بأربعة لترات من عازلة الأسيتات الطازجة واتركها تقليب لمدة أربع إلى خمس ساعات. للحصول على أفضل النتائج ، قم بهذه الخطوة في يوم تركيز البروتين.

لتركيز بروتين علامة MOG ، قم بتبطين قلم بورق الألمنيوم وقم بتغطية رقائق الألومنيوم ب PEG 3350 و PEG 1000 بنسبة واحد إلى واحد. يمكن أن يساعد PEG 3350 في منع تراكم البروتين أثناء التركيز وهو مادة حافظة فعالة للتبريد. ضع بروتين علامة MOG الذي يحتوي على أنبوب جلد الثعبان فوق ورق الألمنيوم وقم بتغطيته ب PEG 8000.

دع هذا يجلس في درجة حرارة الغرفة وتحقق من مستوى الصوت بانتظام حتى يصبح الحجم مساويا أو أقل من الحجم النهائي المقدر. إذا أصبح القلم مشبعا بالماء أثناء عملية التركيز ، فقم بإعداد مقلاة جديدة بورق الألمنيوم و PEG. عينات من البروتين مأخوذة خلال بروتوكول التنقية أو يتم تشغيلها على هلام صفحة SDS لتأكيد النقاء.

يتم عرض هلام تمثيلي يظهر علامة MOG عالية النقاء عند 31.86 كيلو دالتون. للتحقق من أن بروتين علامة MOG قد تم طيه بشكل صحيح ، تم تقييم ارتباط بروتين علامة MOG ب CD19 الإيجابي ، CD4 السلبي ، تسع خلايا بائية من الغدد الليمفاوية من الفئران السوداء الستة من النوع البري C57 أو الفئران IgH MOG التي تعبر عن سلسلة ثقيلة من الغلوبولين المناعي الخاصة ببروتين MOG باستخدام قياس التدفق الخلوي. يتطلب هذا البروتوكول ما لا يقل عن 10 أيام من البداية إلى النهاية.

طوال عملية العزل ، من المهم تتبع البروتين وتذكر ما يجب الاحتفاظ به وما يجب التخلص منه. لا تنس عند استخدام سداسي هيدرات كبريتات النيكل المستخدم في شحن راتنج النيكل ، أمر خطير للغاية ويجب اتخاذ الاحتياطات لمنع الاستنشاق أو ملامسة الجلد أو العينين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنتاج وتنقية بروتين علامة MOG الخاص بك.

بمجرد تنقية بروتين علامة MOG ، يمكن استحلاب بروتين علامة MOG في مادة مساعدة كاملة لفرويند واستخدامه كتحصين للحث على EAE. يمكن استخدام EAE الناجم عن علامة MOG لدراسة مشاركة أنواع متعددة من الخلايا مثل خلايا CD4 أو CDAT أو الخلايا البائية في المناعة الذاتية للجهاز العصبي المركزي. على عكس الببتيد القصير ، المقيد بمعقد التوافق النسيجي الكبير ، يمكن استخدام مستضد البروتين في أي سلالة من الفئران.