دراسة نظام لمراقبة الجودة من البروتين

الهدف العام من تقنية التصوير هذه هو مراقبة الاضطرابات الخلوية الناجمة عن الإجهاد الحراري في خلايا Dictyostelium discoideum. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في فهم آليات الاستجابة للإجهاد الحراري ومراقبة جودة البروتين في الأميبا Dictyostelium discoideum. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في التحكم الدقيق والمحكم في درجة الحرارة المطبقة على تصوير الخلايا.

لبدء الإجراء، قم بتجهيز خلايا Dictyostelium كما هو مفصل في البروتوكول النصي. في اليوم السابق للتصوير، قم بتوزيع الخلايا في وسط منخفض الفلورة (low fluorescence medium) بكثافة 10,000 خلية لكل مليلتر. قبل التصوير، قم بحصد الخلايا من طبق الأنسجة الموجود في LFM، ثم انقل عدداً كافياً من الخلايا إلى أطباق ذات قاعدة زجاجية.

اترك الخلايا لتترسب لمدة 20 دقيقة، ثم استبدل الوسط المستخدم بعناية بوسط جديد لإزالة الخلايا غير المترسبة. قم بتصوير الخلايا في ظروف غير مجهدة عند درجة حرارة 23 °C، مع الحصول على ستة حقول رؤية على الأقل. قم بالتقاط صور Z-stacks بحد أقصى 7 µm وبخطوات تتراوح من 1 إلى 0.25 µm لتصوير كامل حجم الخلية.

بعد ذلك، قم بالتقاط صورة مرجعية بالمجال المضيء لتقييم العدد الإجمالي للخلايا. ثم اضبط درجة حرارة غرفة التبريد على 30 °C. وبعد أن تصل شاشة عرض درجة الحرارة إلى القيمة المطلوبة، أعد ضبط التركيز يدويًا في قناة المجال المضيء.

افحص جميع حقول الرؤية (FOVs) المسجلة قبل بدء التصوير بفاصل زمني، ثم ابدأ تصويراً بفاصل زمني للإجهاد الحراري لمدة أربع ساعات، بفاصل زمني يتراوح من 5 إلى 10 دقائق بين النقاط الزمنية. تحقق من صحة التركيز البؤري أثناء عملية الحصول على أول نقطتين زمنيتين. بعد اكتمال الإجهاد الحراري، خفّض درجة الحرارة لتعود إلى 23 درجة مئوية.

انتظر حتى تضبط شاشة عرض درجة الحرارة وأعد ضبط التركيز يدويًا. بعد ذلك، قم بتسجيل أفلام التصوير الزمني (time-lapse) خلال مرحلة التعافي لمدة تتراوح من 8 إلى 10 ساعات بفواصل زمنية تتراوح من 10 إلى 20 دقيقة. تحقق من صحة التركيز أثناء الحصول على النقطة الزمنية الأولى.

ابدأ بفتح حزمة معالجة الصور المزودة بمكون Cell Counter الإضافي. قم بتحميل سلسلة صور الحقل المضيء بالنقر على File، ثم Open. بعد ذلك، افتح مكون Cell Counter الإضافي، وقم بتحميل سلسلة الصور بالنقر على Initialize.

اختر نوع العدادات بالنقر فوق المربع المناسب. بعد ذلك، قم بعدّ العدد الإجمالي للخلايا، ثم احفظ العلامات بالنقر فوق Save Markers. وبمجرد حفظ العلامات، قم بتحميل الإسقاط الأقصى لمجموعة الصور المكدسة (hyperstack) لصورة التألق.

افتح ملحق عد الخلايا (Cell Counter) وقم بتحميل العلامات بالنقر فوق "تحميل العلامات" (Load Markers). بعد ذلك، اختر نوع العلامة للبؤر السيتوبلازمية وقم بعد الخلايا. يمكن استخدام العلامات الموجودة كدليل لتحديد موقع الخلايا الفردية.

استرجع عدد العدات لكل شريحة من خلال النقر على Results، ثم احفظ العدات في مكان آخر لإجراء المزيد من الحسابات. في هذه الدراسة، تم رصد توزيع بروتين polyglutamine Q103 المرتبط بـ GFP في خلايا Dictyostelium. وفي ظروف النمو الطبيعية، يتوزع Q103-GFP بشكل منتشر في السيتوبلازم.

خلال الإجهاد الحراري، يتجمع الوسم Q103-GFP ليشكل بنيات نقطية. وعند زوال الإجهاد والنمو في ظروف النمو الطبيعية، تتحلل هذه البنيات. ويتم قياس كمية إعادة توزيع Q103-GFP وتكوين البؤر السيتوبلازمية المستحثة بالإجهاد الحراري باستخدام تحليل الصور.

يمكن رؤية النتائج التمثيلية للاستجابة للإجهاد الحراري هنا. يزداد عدد الخلايا التي تحتوي على بؤر Q103-GFP السيتوسولية مع استمرار الإجهاد الحراري. وخلال الإجهاد الحراري، يواجه نظام مراقبة جودة البروتين ضغطاً يفوق قدرته، وبالتالي لا يمكن الحفاظ على البروتينات المعرضة للتكدس في حالة ذائبة.

بعد الإجهاد الحراري، يقل عدد الخلايا التي تحتوي على بؤر سيتوسولية، مما يشير إلى ذوبان البروتينات المتجمعة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية مراقبة الاضطرابات الناجمة عن الإجهاد الحراري في الأميبا *Dictyostelium discoideum*. خلال عملية التصوير، من المهم تذكر التأكد من ضبط التركيز بشكل صحيح، إذا كان مجهرك لا يحتوي على خاصية التركيز التلقائي المدمجة.

يمكن استخدام التحكم في درجة الحرارة الموضح في هذا البروتوكول في مجالات تتجاوز استجابة الإجهاد الحراري. كما أن التصوير تحت ظروف النمو الطبيعية باستخدام التحكم في درجة الحرارة يمكن أن يقلل بشكل ملحوظ من التأثيرات السمية الضوئية.