دراسة نظام لمراقبة الجودة من البروتين D. discoideum عن طريق درجة الحرارة التي تسيطر التصوير الخلية الحية

الهدف العام من تقنية التصوير هذه هو مراقبة الاضطرابات الخلوية الناجمة عن الإجهاد الحراري في خلايا Dictyostelium discoideum. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في فهم آليات الاستجابة للإجهاد الحراري ومراقبة جودة البروتين في الأميبا Dictyostelium discoideum. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التحكم الصارم والدقيق في درجة الحرارة المطبقة على تصوير ملفات الخلايا.

لبدء الإجراء ، قم بإعداد خلايا Dictyostelium كما هو مفصل في بروتوكول النص. في اليوم السابق للتصوير ، قم بتقسيم الخلايا إلى وسط مضان منخفض إلى 10 ، 000 خلية لكل مليلتر. قبل التصوير ، قم بحصاد الخلايا من صفيحة الأنسجة في LFM ، ثم انقل عددا كافيا من الخلايا إلى أطباق ذات قاع زجاجي.

اترك الخلايا تستقر لمدة 20 دقيقة ثم استبدل الوسط المستخدم بعناية بوسط جديد لإزالة الخلايا غير المستقرة. تكتسب خلايا الصورة في ظل ظروف غير مجهدة عند 23 درجة مئوية ما لا يقل عن ستة مجالات رؤية. احصل على مكدسات Z بحد أقصى سبعة ميكرومتر في خطوة واحدة إلى 0.25 ميكرومتر لالتقاط الحجم الكامل للخلية.

ثم احصل على صورة مرجعية للمجال الساطع لتقييم العدد الإجمالي للخلايا. بعد ذلك ، اضبط درجة حرارة غرفة التبريد على 30 درجة مئوية. بعد أن تصل شاشة درجة الحرارة إلى القيمة المطلوبة، أعد التركيز يدويا في قناة المجال الساطع.

تحقق من جميع مجالات الرؤية المسجلة قبل بدء الفاصل الزمني ، ثم ابدأ الفاصل الزمني لمدة أربع ساعات من الإجهاد الحراري مع فاصل زمني من خمس إلى 10 دقائق بين النقاط الزمنية. تحقق للتأكد من صحة التركيز أثناء الحصول على أول نقطتين زمنيتين. بعد اكتمال الإجهاد الحراري ، قلل درجة الحرارة مرة أخرى إلى 23 درجة مئوية.

انتظر حتى يتم ضبط عرض درجة الحرارة وإعادة التركيز يدويا. ثم سجل أفلام الفاصل الزمني في مرحلة الاسترداد لمدة ثماني إلى 10 ساعات في فترات زمنية من 10 إلى 20 دقيقة. تحقق للتأكد من صحة التركيز أثناء الحصول على النقطة الزمنية الأولى.

ابدأ بفتح حزمة معالجة الصور المزودة بالمكون الإضافي Cell Counter. قم بتحميل مكدس صور الحقل الساطع بالنقر فوق ملف، ثم فتح. بعد ذلك ، افتح المكون الإضافي Cell Counter ، وقم بتحميل مكدس الصور بالنقر فوق تهيئة.

اختر نوع العدادات بالنقر فوق المربع المناسب. بعد ذلك ، احسب العدد الإجمالي للخلايا ، واحفظ العلامات بالنقر فوق حفظ العلامات. بمجرد حفظ العلامات، قم بتحميل الحد الأقصى للإسقاط لصورة التألق الفائقة.

افتح المكون الإضافي Cell Counter وقم بتحميل العلامات بالنقر فوق تحميل العلامات. بعد ذلك ، اختر نوع العلامة لبؤر العصارة الخلوية واحسب الخلايا. يمكن استخدام العلامات الموجودة كدليل لموضع الخلايا الفردية.

استرجع عدد الأعداد لكل شريحة بالنقر فوق النتائج ، ثم احفظ الأعداد في مكان آخر لمزيد من العمليات الحسابية. في هذه الدراسة ، لوحظ توزيع بروتين البولي جلوتامين Q103 الموسوم ب GFP في خلايا Dictyostelium. في ظل ظروف النمو الطبيعية ، يتم توزيع Q103-GFP بشكل منتشر في السيتوبلازم.

أثناء الإجهاد الحراري ، تتحد علامة Q103-GFP لثقب الهياكل. عند إطلاق الإجهاد والنمو في ظروف النمو الطبيعية ، تذوب هذه الهياكل. يتم قياس إعادة توزيع Q103-GFP وتشكيل بؤر العصارة الخلوية الناجمة عن الإجهاد الحراري باستخدام تحليل الصور.

يمكن رؤية النتائج التمثيلية لاستجابة الإجهاد الحراري هنا. يزداد عدد الخلايا ذات بؤر Q103-GFP العصارية الخلوية مع استمرار الإجهاد الحراري. أثناء الإجهاد الحراري ، يطغى على نظام مراقبة جودة البروتين ، وبالتالي لا يمكن الحفاظ على البروتينات المعرضة للتجميع في حالة قابلة للذوبان.

بعد الإجهاد الحراري ، ينخفض عدد الخلايا ذات البؤر العصارية الخلوية ، مما يشير إلى أن البروتينات المجمعة تذوب. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية مراقبة الاضطرابات الناجمة عن الإجهاد الحراري في الأميبا Dictyostelium discoideum. أثناء التصوير ، من المهم أن تتذكر التأكد من ضبط التركيز بشكل صحيح ، إذا كان المجهر لا يحتوي على ضبط تلقائي للصورة للأجهزة.

يمكن استخدام التحكم في درجة الحرارة الموضح في هذا البروتوكول خارج مجال استجابة الإجهاد الحراري. يمكن أن يقلل التصوير في ظل ظروف النمو الطبيعية باستخدام التحكم في درجة الحرارة من التأثيرات السامة للضوء بشكل ملحوظ.