تقرير من سطح الخلية النسبي ومجموع التعبير عن قنوات المؤتلف ايون باستخدام التدفق الخلوي

الهدف العام من هذه الطريقة هو تحديد التعبير عن سطح الخلية لبروتينات الغشاء باستخدام مقايسة متباعدة فلورسنت. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن فحوصات قياس التدفق الخلوي توفر نقاط نهاية قابلة للقياس الكمي على كميات كبيرة من الخلايا الحية في تجربة واحدة. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تشخيص وعلاج عدم انتظام ضربات القلب البطيني لأن هذه الأمراض غالبا ما ترتبط بالطفرات الجينية التي تسبب عيوبا في تهريب القنوات الأيونية القلبية.

بشكل عام ، يكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لتحديد موقع إدخال خارجي مناسب للحاتمة لا يضر بوظيفة البروتين ويولد إشارة فلورية قوية في وجود الجسم المضاد المترافق سيوضح هذا الإجراء بينوايت بوردين ، مساعد باحث من مختبري. للبدء ، يبني الحمض النووي المزدوج مع mCherry في الطرف C داخل الخلايا.

أيضا ، عبر عن حاتمة هيماجلوتينين إضافية تواجه الخلوية ، والتي يمكن قياسها باستخدام جسم مضاد مضان لتقدير التعبير عن سطح الخلية لبروتينات الغشاء. بعد ذلك ، قم بزراعة صفيحة من خلايا TSA201 باستخدام التقنيات القياسية حتى تصل إلى التقاء 90٪. لكل عينة ، قم بإعداد كواشف التعداء في أنبوبين.

قم بإعداد أنبوب واحد سعة 1.5 ملليلتر مع أربعة ميكروغرامات من الحمض النووي و 250 ميكرولتر من وسط المصل المختزل ، وأنبوب ثان يحتوي على 10 ميكرولتر من كاشف التعداء بوساطة الجسيم الشحمي و 250 ميكرولتر من وسط المزرعة المختزلة. امزج الأنبوبين برفق واحتضانهما لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، امزج محتويات الأنبوب الأول والأنبوب الثاني برفق واحتضان مجمعات الحمض النووي الشحمية لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

أضف المجمعات إلى الخلايا المستزرعة وهز طبق الثقافة برفق. ضع الطبق مرة أخرى على حرارة 37 درجة مئوية وتحت جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة من إضافة كاشف التعداء ، قم بإزالة الوسيط من طبق الثقافة وغسل الخلايا بعناية باستخدام 400 ميكرولتر من Trypsin-EDTA الدافئ مسبقا.

ثم أضف 400 ميكرولتر من Trypsin-EDTA واحتضن الطبق لمدة خمس دقائق للسماح للخلايا بالانفصال عن الطبق. بمجرد فصله ، أوقف هضم الإنزيم عن طريق إضافة مليلتر واحد من وسط الزراعة الباردة بدون البنسلين أو الستربتومايسين إلى الخلايا. قم بتمرير الوسط برفق فوق اللوحة أربع إلى خمس مرات لغسل جميع الخلايا من السطح.

ثم اجمع الخلايا في أنابيب معقمة سعة 1.5 مليلتر وضعها على الفور على الجليد. للخطوات التالية ، استخدم محلول مثلج وحافظ على الخلايا عند أربع درجات لمنع استيعاب الحاتمة السطحية. أيضا ، قلل من تعرض الخلايا للضوء من أجل الحد من التبييض الضوئي لإشارة الفلورسنت.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنابيب لحبيبات الخلايا. ثم ، استنشق بعناية وتخلص من المادة الطافية الناتجة. أعد تعليق الحبيبات لتحضير معلق خلية واحدة باستخدام مليلتر واحد من PBS.

ثم ، قم بالطرد المركزي للأنابيب. بيليه وإعادة تعليق الخلايا مرة أخرى من أجل إزالة وسط الثقافة تماما. بعد ذلك ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 600 ميكرولتر من PBS.

قم بقياس تركيز الخلية وضبطه على ما لا يقل عن ثلاثة ملايين خلية لكل مليلتر. ثم قسم الخلايا إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 ملليلتر. تأكد من تضمين الضوابط المناسبة للتمييز بين تلطيخ معين وبقع غير محددة وللتلطيخ الخلوي الإضافي وأيضا للتلوين داخل الخلايا.

سيساعد الجسم المضاد للتحكم في النظائر في تقييم مستوى تلطيخ الخلفية ويجب أن يتطابق مع الجسم المضاد الأساسي والنظير الميمون والفلوروفور. من المهم استخدام الجسم المضاد لنظير التحكم والجسم المضاد الفلوري بنفس التركيز. لتقدير التعبير عن سطح الخلية لبروتينات الغشاء ، قم أولا بتسمية حاتمة HA المواجهة للخلية الإضافية فقط باستخدام جسم مضاد مترافق بضوء الفلورسنت.

بعد ذلك ، أضف جسما مضادا أحادي النسيلة مضاد ل HA مترافق مع FITC بمعدل خمسة ميكروغرام لكل مليلتر إلى الأنبوب. دوامة الخلايا لفترة وجيزة ثم احتضانها على منصة هزاز في الظلام. قم بإزالة الخلايا من الظلام وأضف 900 ميكرولتر من PBS.

ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب لحبيبات الخلايا وشفط المادة الطافية. بعد ذلك ، اغسل الخلايا عن طريق تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من PBS ودوامة الخلايا لفترة وجيزة. ثم كرر خطوة الطرد المركزي لتكبيل الخلايا مرة أخرى.

كرر خطوة الغسيل هذه ثلاث مرات لإزالة أي جسم مضاد غير مرتبط. بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS وانقل تعليق الخلية المفردة إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي بسعة خمسة ملليلتر. احتفظ بالخلايا في الظلام عند أربع درجات مئوية حتى يتم تشغيل العينة.

لتقدير التعبير داخل الخلايا للبروتين الكلي ، قم بعد ذلك بتسمية الخلايا المنفذة. يتم تحقيق ذلك باستخدام بروتوكول مشابه لوضع العلامات خارج الخلية ، ولكن مع إضافة مخزن مؤقت لنفاذية الخلية قائم على الصابونين. قم بتكبيل الخلايا ، وتخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من محلول نفاذية التثبيت مباشرة من المخزون المحضر.

احتضان الخلايا في الظلام عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم أضف 100 ميكرولتر من مخزن غسيل النفاذية المحضر حديثا وقم بدوامة الخلايا لفترة وجيزة. بعد ذلك ، قم بتكسير الخلايا وغسلها مرتين أخريين باستخدام مخزن غسيل النفاذية.

بعد ذلك ، أضف الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ل HA المترافق مع FITC بمعدل 5 ميكروغرام لكل مليلتر و 100 ميكرولتر من مخزن غسيل النفاذية. لفترة وجيزة ، تقوم دوامة الخلايا واحتضان الخلايا في الظلام عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من مخزن غسيل النفاذية.

قم بتكسير الخلايا وغسلها ثلاث مرات في 100 ميكرولتر من نفس المخزن المؤقت كما هو موضح سابقا. بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS وانقل تعليق الخلية المفردة إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي بسعة خمسة ملليلتر. قم بتشغيل الخلايا غير المنفذة والنفاذة من خلال مقياس التدفق الخلوي في نفس اليوم.

للبدء ، قم بتشغيل برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي وقم باستيراد ملفات fcs التي تم إنشاؤها أثناء قياس التدفق الخلوي. انقر فوق العينة الأولى وابدأ عملية البوابات في مخطط التشتت الجانبي مقابل التشتت الأمامي. بعد ذلك ، ارسم بوابة P1 باستخدام رمز القطع الناقص حول الخلايا الحية للتخلص من أي حطام أو خلايا ميتة أو مجاميع.

بعد ذلك ، ارسم مخطط كفاف معلمة الأنبوب ل mCherry مقابل شدة مضان FITC. اضبط بوابة P2 حول الخلايا الإيجابية FITC و mCherry وبوابة P3 حول مجموعة الخلايا السالبة الفلورية. بعد ذلك ، حدد البوابات P2 و P3 وانقر فوق رمز إضافة إحصائيات في نافذة مساحة العمل الأصلية.

انقر فوق العد ثم انقر فوق المتوسط. أخيرا ، قم بتطبيق معلمات البوابات والإحصائيات على جميع العينات التي تم فحصها بواسطة مقياس الخلوي. تم استخدام هذا البروتوكول لتوصيف دور N-glycosylation على التعبير الكلي وسطح الخلية ل CaV Alpha 2 Delta 1 في خلايا TSA201.

للوصول إلى تعبير البروتين على سطح الخلية ، تم قياس HA على الخلايا غير المنفذة التي تعطلت فيها مواقع N-glycosylation في أربعة مواقع أو 16 موقعا أو بدون موقع. كانت مستويات FITC قوية في النوع البري وتعطلت الخلايا التي تحتوي على خلايا N-glycosylation في أربعة مواقع ، ولكن تم العثور على مستويات خلفية فقط في الخلايا التي تعطلت فيها 16 موقعا. بالنسبة للخلايا المنفذة ، زاد تألق FITC لجميع الظروف ، مما يشير إلى أن جميع بروتينات CaV Alpha 2 Delta 1 المنقولة ، الموسومة ب HA ، تم تلطيخها واكتشافها بواسطة الجسم المضاد ل HA FITC.

بالإضافة إلى ذلك ، كانت مستويات مضان mCherry متشابهة للخلايا المنفذة وغير المنفذة ، مما يدل على أن النفاذية لا تغير إشارة mCherry النسبية. أظهرت المقايسات التي أجريت بعد نفاذية الخلية أن التعبير الكلي للبروتين للخلايا التي تحتوي على 16 موقعا تعطل قد انخفض أيضا بشكل كبير ، سواء تم استنتاجه من مضان FITC في الخلايا المنفذة أو من مضان mCherry التأسيسي المقاس في الخلايا غير المنفذة وفي الخلايا المنفذة. بالإضافة إلى هذا الإجراء ، يمكن إجراء تسجيلات فسيولوجية إضافية من أجل ربط التعبير عن القنوات الأيونية ووظيفتها.

تمهد هذه التقنية أيضا الطريق للباحثين في المجال الطبي لدراسة تأثير الطفرات الجينية ، والتعديلات اللاحقة للترجمة ، والحمض النووي الريبي الصغير ، و GTPases الصغيرة ودور المرافقين في تهريب بروتينات الغشاء المعبر عنها في الخلايا المؤتلفة أو في الخلايا الأصلية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تحصل على فهم جيد لكيفية إجراء تعداء الحمض النووي في الخلايا المؤتلفة ، لتلطيخ NTAC والخلايا المنفذة ، وكذلك لإجراء تحليل البيانات على العينات. لا تنس أن العمل مع الخلايا الحية يتطلب احتياطات مثل العمل في سائل الهيلامين للتثبيت وارتداء القفازات عند التعامل مع المواد الكيميائية.