تقرير من سطح الخلية النسبي ومجموع التعبير عن قنوات المؤتلف ايون باستخدام التدفق الخلوي

الهدف العام من هذه الطريقة هو قياس التعبير السطحي للخلايا لبروتينات الغشاء باستخدام مقايسة فلورية متباعدة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن مقايسات قياس التدفق الخلوي توفر نقاط نهاية قابلة للقياس الكمي على أحجام كبيرة من الخلايا الحية في تجربة واحدة. وتمتد تطبيقات هذه التقنية نحو تشخيص وعلاج عدم انتظام ضربات القلب البطيني، لأن هذه الحالات المرضية غالباً ما ترتبط بطفرات جينية تسبب عيوباً في نقل القنوات الأيونية القلبية.

بشكل عام، يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة في تحديد موقع إدخال خارج خلوي مناسب للإبيتوب (epitope) بحيث لا يؤثر سلباً على وظيفة البروتين الخاص بهم، ويولد إشارة فلورية قوية في وجود الأجسام المضادة المقترنة. سيقوم بينويت بوردين، وهو مساعد بحث من مختبري، بتوضيح هذا الإجراء. للبدء، قم بوسم بنى DNA المزدوجة بـ mCherry عند الطرف الكربوكسيلي (C-terminus) داخل الخلوي.

بالإضافة إلى ذلك، يتم التعبير عن إيبيتوب (epitope) إضافي لبروتين الهيماغلوتينين (hemmagglutinin) يواجه الخارج الخلوي، والذي يمكن قياسه باستخدام جسم مضاد فلوري لتقدير تعبير بروتينات الغشاء على سطح الخلية. بعد ذلك، يتم استزراع طبق من خلايا TSA201 باستخدام التقنيات القياسية حتى تصل إلى 90% من درجة التلاحم (confluence). ولكل عينة، يتم تحضير كواشف عفن الخلية (transfection) في أنبوبين.

قم بتجهيز أنبوب سعة 1.5 milliliter يحتوي على 4 micrograms من الـ DNA و 250 microliters من وسط مصل مخفض، وأنبوب ثانٍ يحتوي على 10 microliters من كاشف ترانسفكشن بوساطة الليبوزوم و 250 microliters من وسط استزراع مصل مخفض. امزج محتويات الأنبوبين برفق واتركهما للحضانة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، ادمج محتويات الأنبوب الأول والأنبوب الثاني برفق واترك معقدات الليبوزوم والـ DNA للحضانة لمدة 20 minutes في درجة حرارة الغرفة.

أضف المعقدات إلى الخلايا المستنبتة وهز طبق الاستنبات بلطف. أعد الطبق إلى درجة حرارة 37 °C وتحت جو يحتوي على 5% carbon dioxide لمدة 24 ساعة. بعد مرور 24 ساعة من إضافة كاشف عفن الخلايا (transfection reagent)، أزل الوسط من طبق الاستنبات واغسل الخلايا بعناية باستخدام 400 µL من Trypsin-EDTA المُدفأ مسبقاً.

بعد ذلك، أضف 400 µL من Trypsin-EDTA واحضن الطبق لمدة خمس دقائق للسماح للخلايا بالانفصال عن الطبق. وبمجرد انفصالها، أوقف عملية الهضم الإنزيمي بإضافة 1 mL من وسط زراعة بارد خالٍ من penicillin أو streptomycin إلى الخلايا. استخدم الماصة لنقل الوسط برفق فوق الطبق من أربع إلى خمس مرات لغسل جميع الخلايا من السطح.

بعد ذلك، يتم تجميع الخلايا في أنابيب معقمة سعة 1.5 milliliter ووضعها على الثلج فوراً. وفي الخطوات التالية، استخدم محلولاً مبرداً بالثلج وحافظ على الخلايا عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لمنع استدخال الحاتمة السطحية. كما يجب تقليل تعرض الخلايا للضوء للحد من التبييض الضوئي للإشارة الفلورية.

بعد ذلك، قم بطرد الأنابيب مركزياً لترسيب الخلايا. ثم، اسحب السائل الطافي الناتج بعناية وتخلص منه. أعد تعليق الراسب لتحضير معلق خلوي مفرد باستخدام 1 mL من PBS.

بعد ذلك، قم بطرد مركزي قصير للأنابيب. قم بترسيب الخلايا وإعادة تعليقها مرة أخرى من أجل إزالة وسط الزرع تماماً. بعد ذلك، أعد تعليق راسب الخلايا في 600 microliters من PBS.

قم بقياس تركيز الخلايا وضبطه ليكون ثلاثة ملايين خلية لكل ملليلتر على الأقل. بعد ذلك، وزع الخلايا في أنابيب جديدة سعة 1.5 ملليلتر. تأكد من تضمين الضوابط المناسبة للتمييز بين الصبغ النوعي والصبغ غير النوعي، وكذلك لعمليات الصبغ خارج الخلوية والصبغ داخل الخلوية.

سيساعد الجسم المضاد الضابط للنظير في تقييم مستوى التلوين الخلفي، ويجب أن يتطابق مع الجسم المضاد الأولي من حيث النظير والفلوروفور. ومن المهم استخدام الجسم المضاد الضابط للنظير والجسم المضاد الفلوري بنفس التركيز. ولتقدير التعبير السطحي لبروتينات الغشاء على الخلية، قم أولاً بتمييز الحاتمة HA المواجهة للخارج الخلوي فقط باستخدام جسم مضاد مقترن بصبغة فلورية.

بعد ذلك، أضف جسماً مضاداً أحادي النسيلة مضاداً لـ HA مقترناً بـ FITC بتركيز 5 µg/mL إلى الأنبوب. قم برج الخلايا بجهاز vortex لفترة وجيزة، ثم حضنها على منصة هزازة في الظلام. أخرج الخلايا من الظلام وأضف 900 µL من PBS.

بعد ذلك، قم بطرد الأنبوب مركزياً لترسيب الخلايا، ثم اسحب السائل الطافي. بعد ذلك، اغسل الخلايا عن طريق إعادة تعليق الراسب في 1 mL من PBS ورج الخلايا لفترة وجيزة باستخدام جهاز الفورتكس. ثم كرر خطوة الطرد المركزي لترسيب الخلايا مرة أخرى.

كرر خطوة الغسل هذه ثلاث مرات إجمالاً لإزالة أي أجسام مضادة غير مرتبطة. بعد الغسل النهائي، أعد تعليق الخلايا في 500 µL من PBS وانقل معلق الخلايا المفردة إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي سعة 5 mL. تُحفظ الخلايا في الظلام عند درجة حرارة 4 °C حتى يتم تحليل العينة.

لتقدير التعبير داخل الخلوي لإجمالي البروتين، قم بعد ذلك بوضع علامة على الخلايا المنفذة. يتم تحقيق ذلك باستخدام بروتوكول مشابه للوسم خارج الخلوي، ولكن مع إضافة محلول منظم لنفاذية الخلايا يعتمد على السابونين. قم بترسيب الخلايا، وتخلص من السائل الطافي، ثم أعد تعليق الخلايا في 100 µL من محلول التثبيت والنفاذية مباشرة من المخزون المُعد.

يُحضن الخلايا في الظلام عند درجة حرارة 4 °C لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، يتم إضافة 100 µL من محلول غسيل النفاذية المُحضّر حديثاً، وتُرج الخلايا باستخدام جهاز الـ vortex لفترة وجيزة. ثم تُرسّب الخلايا وتُغسل مرتين إضافيتين باستخدام محلول غسيل النفاذية.

بعد ذلك، أضف الجسم المضاد أحادي النسيلة لـ HA المقترن بـ FITC بتركيز 5 micrograms per milliliter و 100 microliters من محلول غسيل النفاذية. قم برج الخلايا باستخدام جهاز الفورتيكس لفترة وجيزة، ثم حضن الخلايا في الظلام عند درجة حرارة 4 °C لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، أضف 100 microliters من محلول غسيل النفاذية.

قم بترسيب الخلايا وغسلها ثلاث مرات في 100 µL من المحلول المنظم نفسه الموضح سابقاً. وبعد الغسلة الأخيرة، أعد تعليق الخلايا في 500 µL من PBS وانقل معلق الخلايا المفردة إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي سعة خمسة ملليلتر. قم بتحليل الخلايا غير المنفذة والخلايا المنفذة بواسطة مقياس التدفق الخلوي في اليوم نفسه.

للبدء، قم بتشغيل برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي واستورد ملفات fcs التي تم إنشاؤها أثناء عملية قياس التدفق الخلوي. انقر فوق العينة الأولى وابدأ عملية تحديد البوابات (gating) في المخطط الذي يوضح التشتت الجانبي (side scatter) مقابل التشتت الأمامي (forward scatter). بعد ذلك، ارسم البوابة P1 باستخدام أيقونة الشكل البيضاوي حول الخلايا الحية لاستبعاد أي حطام خلوي أو خلايا ميتة أو تجمعات خلوية.

بعد ذلك، قم برسم مخطط كفافي لمعلمات الأنبوب لشدة الفلورة لـ mCherry مقابل FITC. حدد بوابة P2 حول الخلايا الموجبة لـ FITC وmCherry، وبوابة P3 حول مجموعة الخلايا السالبة للفلورة. بعد ذلك، اختر البوابتين P2 وP3 وانقر على أيقونة إضافة الإحصائيات في نافذة مساحة العمل الأصلية.

انقر فوق count ثم انقر فوق mean. وأخيراً، قم بتطبيق معايير البوابات والإحصائيات على جميع العينات التي تم فحصها بواسطة جهاز قياس التدفق الخلوي. استُخدم هذا البروتوكول لتوصيف دور N-glycosylation في التعبير الكلي والتعبير على سطح الخلية لـ CaV Alpha 2 Delta 1 في خلايا TSA201.

للوصول إلى البروتينات المعبر عنها على سطح الخلية، تم قياس HA في خلايا غير منفذة كانت مواقع الارتباط السكري N-glycosylation فيها معطلة في أربعة مواقع، أو 16 موقعاً، أو بدون أي تعطل. كانت مستويات FITC قوية في النوع البري وفي الخلايا التي عُطلت فيها مواقع N-glycosylation في أربعة مواقع، بينما وُجدت مستويات خلفية فقط في الخلايا التي عُطلت فيها 16 موقعاً. أما بالنسبة للخلايا المنفذة، فقد زاد فلورسنت FITC في جميع الظروف، مما يشير إلى أن جميع بروتينات CaV Alpha 2 Delta 1 التي تم نقلها جينياً والموسومة بـ HA قد صُبغت وكُشف عنها بواسطة الجسم المضاد anti HA FITC.

بالإضافة إلى ذلك، كانت مستويات فلورة mCherry متشابهة في الخلايا المنفذة وغير المنفذة، مما يشير إلى أن عملية النفاذ لا تغير إشارة mCherry النسبية. وأظهرت المقايسات التي أجريت بعد نفاذ الخلايا أن التعبير البروتيني الكلي للخلايا التي تعطلت فيها 16 موقعاً قد انخفض بشكل ملحوظ أيضاً، وسواء تم استنتاج ذلك من فلورة FITC في الخلايا المنفذة أو من فلورة mCherry التأسيسية المقاسة في الخلايا غير المنفذة والمنفذة. وبالإضافة إلى هذا الإجراء، يمكن إجراء تسجيلات فسيولوجية إضافية من أجل ربط التعبير ووظيفة القنوات الأيونية.

تمهد هذه التقنية الطريق أيضاً للباحثين في المجال الطبي لدراسة تأثير الطفرات الجينية، والتعديلات ما بعد الترجمة، وجزيئات microRNAs، وبروتينات small GTPases، ودور المرافقات الجزيئية (chaperones) في نقل بروتينات الغشاء التي يتم التعبير عنها في الخلايا المؤشبة أو الخلايا الأصلية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء ترانسفكشن الـ DNA في الخلايا المؤشبة، وكيفية صبغ NTAC والخلايا المنفذة، بالإضافة إلى كيفية إجراء تحليل البيانات على العينات. لا تنسَ أن العمل مع الخلايا الحية يتطلب اتخاذ احتياطات، مثل العمل داخل تدفق الهواء الصفائحي (laminar flow) أثناء عملية الترانسفكشن وارتداء القفازات عند التعامل مع المواد الكيميائية.