استخدام خرطوشة مرشح للترشيح المياه العينات واستخلاص الحمض النووي البيئي

الهدف العام من هذا البروتوكول هو ترشيح عينات المياه باستخدام خرطوشة ترشيح واستخلاص الحمض النووي البيئي دون الحاجة إلى قطع الغلاف لإزالة المرشح، وذلك من أجل إجراء تحليل الباركود الشامل (metabarcoding) للحمض النووي البيئي (eDNA) من كائنات مائية متنوعة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في المجال البيئي، مثل مراقبة التنوع البيولوجي وإيكولوجيا المجتمعات. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن خراطيش الترشيح يمكنها استيعاب أحجام أكبر من المياه، كما يمكن إجراء عمليات الترشيح واستخلاص الحمض النووي بطريقة معقمة.

لبدء هذا الإجراء، قم بتوصيل أنبوب تفريغ عالي بالوصلة المدخلة لمضخة الشفط. قم بتوصيل الطرف الآخر من الأنبوب بمجمّع. تأكد من أن صمامات T الحمراء الثلاثة الموجودة في المجمّع في وضع الإغلاق.

بعد ذلك، ارتدِ مجموعة نظيفة من القفازات. أدخل وصلة لوير (luer) أنثوية في الطرف العلوي لأنبوب المطاط المخصص للتفريغ. ثم، أدخل موصل تفريغ في الطرف السفلي.

قم بتوصيل وصلة لوير (luer) الأنثوية بعناية بمنفذ المخرج في خرطوشة المرشح. بعد ذلك، قم بتوصيل موصل التفريغ بسدادة من السيليكون. صب لتر واحد من المياه المأخوذة كعينة في الكيس البلاستيكي المجهز.

قم بتركيب الغطاء اللولبي المزود بوصلة luer-lock الذكرية. بعد ذلك، قم بتوصيل منفذ الدخول لخرطوشة المرشح المجمعة بعناية مع وصلة luer-lock الذكرية. تأكد من إحكام جميع الوصلات.

بعد ذلك، علّق الكيس البلاستيكي باستخدام مسمارين من لوحة الشبكة. أدخل سدادة سيليكون في منفذ الإدخال بالمجمّع. ثم، قم بتشغيل الشفاط.

افتح صمامات T الحمراء لبدء عملية الترشيح. قم بتشغيل المجمّع حتى تجف خرطوشة المرشح، ثم أغلق صمامات T الحمراء.

كرر هذه العملية بالكامل لترشيح الكمية المطلوبة من الماء. وبمجرد ترشيح جميع عينات المياه، أخرج خرطوشة الترشيح بعناية من الكيس البلاستيكي وحاوية التفريغ. أغلق كلا طرفي الخرطوشة باستخدام أغطية luer المناسبة.

بعد ذلك، وباستخدام قلم مقاوم للمذيبات، قم بوضع علامة تعريفية على الخرطوشة وغطاء لوير للمدخل. تُحفظ في درجة حرارة 20 °C حتى يحين موعد إجراء استخلاص DNA. بالنسبة للعينات التي تزيد عن أربعة لترات، قم بتجهيز زجاجة سعة عشرة لترات كما هو مفصل في البروتوكول المكتوب.

أضف عينة المياه المراد ترشيحها. بعد ذلك، أدخل طرف ماصة سعة 10 mL بإحكام في صمام القارورة. ثم أدخل منفذ الإدخال لخرطوشة المرشح بإحكام في طرف الماصة.

بعد ذلك، أدخل سدادة سيليكون في فتحة الإدخال الخاصة بالمجمّع. قم بتشغيل جهاز الشفط. ثم افتح صمامات T الحمراء لبدء عملية الترشيح.

قم بتشغيل المجمّع حتى تجف خرطوشة المرشح. بعد اكتمال عملية الترشيح، أغلق صمامات T الحمراء. أزل الخرطوشة بعناية من الكيس البلاستيكي وموصل التفريغ.

ثم قم بتغطية كلا طرفي الخرطوشة بأغطية لوير (luer caps) المناسبة. استخدم قلماً مقاوماً للمذيبات لتمييز الخرطوشة وغطاء لوير الخاص بالمدخل. تُحفظ في درجة حرارة 20 درجة مئوية حتى يحين وقت إجراء استخلاص DNA.

قم بتسخين حاضنة مسبقاً إلى 56 °C. بعد ذلك، قص الغطاء المفصلي لأنبوب سعة 2.0 mL وتخلص من الغطاء. ثم قم بإزالة غطاء لور للمدخل من خرطوشة المرشح.

بعد ذلك، أدخل منفذ الإدخال في أنبوب سعة 2.0 milliliter. وباستخدام غشاء ذاتي الإغلاق، أحكم إغلاق الوصلة بين الخرطوشة وأنبوب التجميع. ثم، أدخل الوحدة المجمعة في محول جهاز طرد مركزي مخصص لأنبوب مخروطي سعة 15 milliliter.

قم بطرد خرطوشة الترشيح مركزياً لمدة دقيقة واحدة عند 5000 ×g لإزالة السائل المتبقي في المرشح. وبمجرد اكتمال عملية الطرد المركزي، قم بإزالة أنبوب الجمع من خرطوشة المرشح وتخلص من الأنبوب. بعد ذلك، أعد إغلاق منفذ الإدخال بالغطاء.

بعد ذلك، اخلط 20 µL من محلول protein A-Case، و220 µL من المحلول الملحي الموقوت بالفوسفات (phosphate-buffered saline)، و200 µL من المنظم AL. قم بإزالة غطاء المدخل وأضف الخليط إلى الخرطوشة باستخدام الماصة، مع إدخال الماصة بالكامل في فتحة المدخل. أعد إغلاق فتحة المدخل. ثم ضع خرطوشة الترشيح على هزاز دوراني.

ضع الهزاز الدوار في الحاضنة التي تم تسخينها مسبقاً، واضبط الهزاز على 20 rpm لمدة 20 دقيقة. أثناء فترة الحضن، قم بتمييز أنبوب جديد سعة 2.0 milliliter باستخدام قلم مقاوم للمذيبات. ثم، ضعه داخل أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter.

بعد اكتمال عملية الحضن، قم بإزالة غطاء المدخل. بعد ذلك، أدخل منفذ المدخل في أنبوب جديد سعة 2.0 milliliter. أغلق الأنبوب المخروطي باستخدام غطاء لولبي.

قم بالطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 5000 ×g لتجميع الحمض النووي DNA المستخلص. بعد ذلك، قم بإزالة الخرطوشة الموجودة في الأنبوب سعة 2.0 milliliter باستخدام ملقط معقم. أغلق الأنبوب وقم بتنقية الحمض النووي DNA المستخلص كما هو موضح في البروتوكول النصي.

في هذا الإجراء، يتم ترشيح أربعة أحجام مختلفة من مياه البحر على نفس المجمع باستخدام مرشحين فريدين، ثم يتم استخلاص الحمض النووي البيئي (eDNA) لاحقاً. وقد كشفت خرطوشة الترشيح، في المتوسط، عن أنواع أكثر بنسبة 50% مقارنة بمرشحات الألياف الزجاجية. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون ساعتين إذا نُفذت بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية ترشيح عينات المياه باستخدام خرطوشة ترشيح، وكيفية استخلاص الـ eDNA دون الحاجة إلى قطع الغلاف لإزالة المرشح من أجل إجراء تحليل الـ metabarcoding للـ eDNA من مختلف الكائنات المائية.