استخدام خرطوشة مرشح للترشيح المياه العينات واستخلاص الحمض النووي البيئي

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تصفية عينات المياه باستخدام خرطوشة مرشح واستخراج الحمض النووي البيئي دون الحاجة إلى قطع الغلاف لإزالة المرشح من eDNA من الكائنات المائية المختلفة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال البيئي ، مثل مراقبة التنوع البيولوجي وبيئة المجتمع. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن خراطيش المرشح يمكن أن تستوعب كميات أكبر من المياه ويمكن إجراء الترشيح واستخراج الحمض النووي بطريقة معقمة.

لبدء هذا الإجراء ، قم بتوصيل أنبوب التفريغ العالي بموصل الإدخال لمضخة الشفاطة. نعلق الطرف الآخر من الأنبوب إلى مشعب. تأكد من أن الصمامات T الحمراء الثلاثة في المشعب في وضع إيقاف التشغيل.

بعد ذلك ، ارتد مجموعة نظيفة من القفازات. أدخل تركيبة أنثوية في الطرف العلوي من الأنبوب المطاطي المفرغ. ثم أدخل موصل فراغ في الطرف السفلي.

قم بتوصيل تركيب اللور الأنثوي بعناية بمنفذ مخرج خرطوشة الفلتر. ثم قم بتوصيل موصل التفريغ بسدادة سيليكون. صب لترا واحدا من الماء المأخوذ في الكيس البلاستيكي المجهز.

قم بإحاطة الغطاء اللولبي بموصل قفل اللور. بعد ذلك ، قم بتوصيل منفذ مدخل خرطوشة الفلتر المجمعة بعناية بموصل قفل اللور. تأكد من أن جميع الاتصالات آمنة.

ثم قم بتعليق الكيس البلاستيكي من شقين على اللوحة الشبكية. أدخل سدادة سيليكون في منفذ مدخل المشعب. ثم قم بتشغيل الشفاطة.

افتح الصمامات T الحمراء للترشيح. قم بتشغيل المشعب حتى تجف خرطوشة الفلتر. ثم أغلق الصمامات T الحمراء.

كرر هذه العملية برمتها لتصفية الكمية المطلوبة من الماء. بمجرد تصفية جميع المياه التي تم أخذ عينات منها ، قم بإزالة خرطوشة الفلتر بعناية من الكيس البلاستيكي وحاوية التفريغ. قم بتغطية طرفي الخرطوشة بأغطية اللور المناسبة.

ثم ، باستخدام قلم مقاوم للمذيبات ، قم بتسمية الخرطوشة وغطاء المدخل. يحفظ على حرارة 20 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا لإجراء استخراج الحمض النووي. بالنسبة للعينات التي يزيد حجمها عن أربعة لترات ، قم بإعداد زجاجة كتاب سعة عشرة لترات كما هو مفصل في بروتوكول النص.

أضف عينة الماء المراد تصفيتها. بعد ذلك ، أدخل بإحكام طرف ماصة سعة عشرة ملليلتر في صمام زجاجة الكتاب. أدخل منفذ مدخل خرطوشة الفلتر بإحكام في طرف الماصة.

ثم أدخل سدادة سيليكون في منفذ مدخل المشعب. قم بتشغيل الشفاطة. ثم افتح الصمامات T الحمراء للترشيح.

قم بتشغيل المشعب حتى تجف خرطوشة الفلتر. بعد اكتمال الترشيح ، أغلق الصمامات T الحمراء. قم بإزالة الخرطوشة بعناية من الكيس البلاستيكي وموصل الفراغ.

ثم قم بتغطية طرفي الخرطوشة بأغطية اللور المناسبة. استخدم قلما مقاوما للمذيبات لتسمية الخرطوشة وغطاء طلاء المدخل. يحفظ على حرارة 20 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا لإجراء استخراج الحمض النووي.

سخني الحاضنة على حرارة 56 درجة مئوية. ثم قم بقص الغطاء المفصلي من أنبوب سعة 2.0 مليلتر وتخلص من الغطاء. قم بإزالة غطاء المدخل من خرطوشة الفلتر.

ثم أدخل منفذ المدخل في أنبوب 2.0 ملليلتر. باستخدام فيلم ذاتي الغلق ، أغلق الاتصال بين الخرطوشة وأنبوب التجميع بإحكام. بعد ذلك ، أدخل الوحدة المدمجة في محول الطرد المركزي لأنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا.

الطرد المركزي الخرطوشة لمدة دقيقة واحدة بمعدل 5000 مرة جم لإزالة السائل المتبقي في الفلتر. بمجرد اكتمال الطرد المركزي ، قم بإزالة أنبوب التجميع من خرطوشة الفلتر وتخلص من الأنبوب. ثم قم بتلخيص منفذ المدخل.

بعد ذلك ، اخلطي 20 ميكرولترا من محلول البروتين A-Case ، و 220 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، و 200 ميكرولتر من AL العازلة. قم بإزالة غطاء المدخل وأضف الخليط إلى الخرطوشة باستخدام ماصة، وأدخل الماصة بالكامل في منفذ المدخل. تلخيص منفذ المدخل. ثم ضع خرطوشة الفلتر على شاكر دوار.

ضع الخلاط الدوار في الحاضنة المسخنة مسبقا ، واضبط الخلاط على 20 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة. أثناء الحضانة ، قم بتسمية أنبوب جديد سعة 2.0 مليلتر بقلم مقاوم للمذيبات. ثم ضعه في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

بعد اكتمال الحضانة ، قم بإزالة غطاء المدخل. ثم أدخل منفذ المدخل في أنبوب 2.0 مليلتر الجديد. قم بتغطية الأنبوب المخروطي بغطاء لولبي.

جهاز طرد مركزي لمدة دقيقة واحدة بمعدل 5000 مرة جم لجمع الحمض النووي المستخرج. ثم قم بإزالة الخرطوشة في أنبوب 2.0 مليلتر باستخدام ملقط معقم. قم بتغطية الأنبوب وتنقية الحمض النووي المستخرج كما هو موضح في بروتوكول النص.

في هذا الإجراء ، يتم ترشيح أربعة أحجام مختلفة من مياه البحر على نفس المشعب باستخدام مرشحين فريدين ، ويتم استخراج eDNA لاحقا. اكتشفت خرطوشة الفلتر ، في المتوسط ، أنواعا أكثر بنسبة 50٪ من مرشحات الألياف الزجاجية. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصفية عينات المياه باستخدام خرطوشة المرشح ، وكيفية استخراج eDNA دون الحاجة إلى قطع الغلاف لإزالة المرشح من eDNA من الكائنات المائية المختلفة.