وسيلة فعالة لتخليق Peptoids مع مونمرات مختلط ليسين من نوع / ارجينين من نوع وتقييم نشاطهم مكافحة يشماني

الهدف العام من هذا الإجراء هو إدخال كل من مونومرات من نوع اللايسين والأرجينين ضمن نفس التسلسل الببتويد وتقييم نشاط هذه المركبات ضد الليشمانيا المكسيكية ، الطفيليات المسببة لمرض الليشمانيات الجلدي المسبب للمرض الاستوائي المهمل. هناك حاجة ماسة إلى علاجات جديدة لداء الليشمانيات الجلدية ، ويمكن أن يساعد هذا الإجراء في تحديد الببتويدات وتطويرها كفئة جديدة من مضادات العدوى المحتملة لهذا المرض الاستوائي المهمل. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه يمكن تصنيع الببتويدات التي تحتوي على وظائف كاتيونية مختلطة.

هذا أمر مرغوب فيه للغاية لأنه يمكن أن يساعد في تعديل الأنشطة البيولوجية للتسلسلات. على الرغم من أن هذا يختبر الشكل الثديي للطفيلي ، إلا أنه يمكن استخدامه أيضا ضد مرحلة الحشرات في Leishmania mexicana أو تطبيقه على خطوط خلايا الثدييات. العرض المرئي لهذه الطريقة مفيد حقا لأنه يوضح الطبيعة التدريجية للتوليف وكذلك الثقافة الطفيلية في نقاط مختلفة من دورة حياة الليشمانيا المكسيكية.

لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد المحاليل في ثنائي ميثيل فورماميد كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك ، أضف 0.1 ملليمول من راتنج أميد حلبة التزلج المحمي ب Fmoc إلى وعاء تفاعل بولي بروبيلين مغطى سعة 20 مليلتر مع اثنين من الفريت. أضف خمسة ملليلتر من ثنائي ميثيل فورماميد واترك الوعاء يقف لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بتصريف DMF باستخدام منصة تفريغ لاستخراج الطور الصلب. بعد ذلك ، أضف ملليلترين من محلول البيبيريدين المحضر. ضع الوعاء على منصة شاكر عند 450 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة ورجه لمدة خمس دقائق.

صفي المحلول باستخدام محطة التفريغ. ثم أضف ملليلترين من محلول البيبريدين ورجه في نفس الظروف لمدة 15 دقيقة. بعد اكتمال الاهتزاز ، قم بتصريف المحلول عبر محطة تفريغ.

أضف ملليلترين من DMF واخلطهم لمدة 30 ثانية لغسل الراتنج. صفي DMF وكرري الغسيل ثلاث مرات. لبدء تخليق المونومر ، أضف ملليلتر واحد من محلول حمض البروموسيتيك المحضر و 0.2 مل من محلول DIC المحضر.

رج العبوة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم صفي المحلول واغسليه ثلاث مرات باستخدام ملليلترين من DMF في كل مرة. أضف ملليلتر واحد من محلول الأمين المحضر.

ثم رج الراتنج لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. صفي المحلول واغسل الراتنج ثلاث مرات باستخدام ملليلترين من DMF في كل مرة. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من محلول حمض البروموسيتيك و 0.2 مل من محلول DIC.

رج العبوة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم صفي المحلول واغسليه ثلاث مرات باستخدام ملليلترين من DMF في كل مرة. لإدخال مونومر يعمل بجوانيدين ، أضف ملليلترا واحدا من محلول ديامين غير المحمي إلى الراتنج.

رج العبوة لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم صفي المحلول واغسل الراتنج بملليلترين من DMF ثلاث مرات. أضف 0.5 مل من محلول 2-أسيتيل ديميدون المحضر.

رج العبوة لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم صفي المحلول واغسل الراتنج بملليلترين من DMF ثلاث مرات. استمر في تخليق المونومر الفرعي حتى يتم إجراء التسلسل المطلوب.

ثم أضف أربعة ملليلتر من محلول الهيدرازين المحضر ورجه لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. صفي المحلول وكرري العملية ثلاث مرات. ثم اغسل الراتنج ثلاث مرات باستخدام ملليلترين من DMF لكل غسلة.

أضف DIPEA وستة مكافئات من البيرازول -1-كاربوكساميد لكل أمين حر في التسلسل الببتوي. رج العبوة لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد اكتمال الاهتزاز ، قم بتصريف المحلول.

اغسل الراتنج ثلاث مرات باستخدام ملليلترين من ثنائي كلورو ميثان لكل غسلة. جفف الراتنج في الهواء لمدة 10 دقائق واحفظه للاستخدام في المستقبل. يمكن إجراء شق الاختبار بعد إضافات الأمين للتحقق من تقدم التوليف.

لبدء الانقسام النهائي ، أضف أربعة ملليلتر من كوكتيل الانقسام إلى نفس خرطوشة التفاعل الممزق المستخدمة في التوليف وقم بتغطية الوعاء. يرج لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم باستخدام وعاء التفاعل المتجكف ، قم بتصفية كوكتيل الانقسام من الراتنج إلى قارورة مستديرة القاع.

تبخر كوكتيل الانقسام باستخدام مبخر دوار. أضف ملليلترين من ثنائي إيثيل الأثير اللامائي لترسيب الببتويد. باستخدام ماصة ، قم بإزالة ثنائي إيثيل الأثير وتخلص منه.

ثم كرر ترسيب ثنائي إيثيل الأثير ثلاث مرات. بمجرد اكتمال هطول الأمطار ، قم بإذابة الببتويد الخام في 10 مل من الأسيتونيتريل المحضر ومحلول الماء المحمض. انقله إلى حاوية موزونة مسبقا.

ثم قم بالتجميد عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر وقم بالتجميد إلى مسحوق جاف جاهز للتنقية عن طريق HPLC في المرحلة العكسية. بعد استزراع طفيليات الليشمانيا المكسيكية والتحول إلى مرحلة الأكسينيك ، ابدأ مقايسة السمية الخلوية عن طريق تحضير محاليل المخزون المركب كما هو موضح في بروتوكول النص. أضف ميكرولترين من محلول مخزون الببتويد بسعة خمسة ملليمول، وعنصر تحكم الأمفوتريسين B والتحكم في DMSO إلى الصف العلوي من لوحة 96 بئرا كما هو موضح في بروتوكول النص.

باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 48 ميكرولترا من الوسط الطازج إلى الصف العلوي. أضف 25 ميكرولترا من الوسط الطازج إلى جميع الصفوف الأخرى. بعد ذلك ، قم بإجراء تخفيف تسلسلي عن طريق سحب 25 ميكرولترا من المحلول من الصف العلوي ، وإضافته إلى الصف أدناه والخلط.

كرر عمليات التخفيف للوحة بأكملها مع التخلص من آخر 25 ميكرولترا تم سحب ماصاتها من الصف السفلي. ثم انقل ثقافة الطفيليات إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. جهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق عند 447 مرة جم.

يسكب الوسط القديم ويضاف 10 مل من الوسط الطازج. بعد ذلك باستخدام ماصة ، أعد تعليق حبيبات الطفيليات برفق في الوسط الجديد. عد باستخدام مقياس الدم المحسن من Neubauer وتخفيف الثقافة إلى ثمانية ملايين طفيلي لكل مليلتر.

بعد تخفيف الثقافة ، أضف 25 ميكرولترا من الطفيليات إلى كل بئر. احتضن الطبق لمدة 60 دقيقة عند 32 درجة مئوية. بمجرد اكتمال الحضانة ، قم بإزالة 40 ميكرولترا من المحلول من كل بئر.

أضف 90 ميكرولترا من الوسط الطازج إلى كل بئر واحتضنه عند 32 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولترات من محلول صلاحية الخلية القائم على الريزازورين إلى كل بئر. احتضان عند 32 درجة مئوية لمدة أربع ساعات.

بعد اكتمال الحضانة ، استخدم قارئ اللوحة لقياس التألق. قم بتحليل البيانات عن طريق إزالة متوسط الخلفية ومقارنة مضان الآبار بعد التطبيع مع الاستئصال بعناصر تحكم DMSO. في هذه الدراسة ، يتم تصنيع اثنين من الببتويدات باستخدام 120 ملليغرام من راتنج أميد حلبة التزلج لكل منهما.

يتم تنقية المنتجات عن طريق كروماتوغرافيا السائل عالي الضغط ذات الطور العكسي ، ويتم دمج الكسور المقابلة للكتلة المستهدفة والحصول عليها كمساحيق بيضاء. يتم عرض الكمية التي تم جمعها للببتويدات هنا بإنتاجية تبلغ حوالي 30٪ للكسور التي تزيد عن 90٪ نقية. يتم تقييم نقاء المنتج باستخدام HPLC التحليلي ذو الطور العكسي ويتم تصوره عند 220 نانومتر ، وهو امتصاص العمود الفقري للأميد.

ينظر إلى الببتويدات على أنها متجانسة. النتائج التمثيلية لمقايسات السمية الخلوية ضد L Mexicana موضحة هنا. يتم تصنيع محاليل مخزون خمسة مللي مولار من المركبات في DMSO من فئة زراعة الخلايا ويتم اختبارها في ثلاث نسخ مرتين على الأقل لضمان بيانات قوية.

يمكن ملاحظة أن الببتويد B أكثر فعالية من الببتويد أ في تقليل النسبة المئوية للطفيليات القابلة للحياة مع كلاهما لهما تأثير يعتمد على الجرعة. بعد مشاهدة هذه الطريقة ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع وتوصيف وتنقية الببتويدات التي تحتوي على كل من مونومرات نوع اللايسين ونوع الأرجينين وكيفية استخدامها في فحوصات السمية الخلوية ضد الليشمانيا المكسيكية. تضيف طريقتنا لإضافة وظيفة كاتيونية مزدوجة إلى الببتويدات خطوة واحدة بسيطة فقط إلى طريقة المونومر الفرعي شائعة الاستخدام لتخليق الببتويد.

باتباع هذه الطريقة ، يمكن إضافة مونومرات فرعية من نوع اللايسين أو الأرجينين بأطوال مختلفة للمساعدة في زيادة تنوع المكتبة ، على سبيل المثال ، مع سلاسل جانبية من اثنين إلى ستة كربون في الطول. أثناء محاولة تخليق الببتويد ، من المهم حقا أن تتذكر غسل الراتنج جيدا بين الخطوات لمنع منتجات الإضافة أو الحذف غير المرغوب فيها. تمهد هذه الطريقة الطريق للباحثين لاستكشاف النشاط البيولوجي للببتويدات المختلطة الوظيفية الكاتيونية ومقارنة هذا النشاط بتلك التي تحتوي على مونومرات من نوع اللايسين أو الأرجينين حصريا.

أخيرا ، لا تنس أن الطفيليات والعديد من الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول يمكن أن تكون خطيرة للغاية. لذلك ، من المهم دائما استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة والعمل داخل غطاء الدخان أو خزانة السلامة الميكروبيولوجية عند الاقتضاء.