التحليل الطيفي والرنين المغناطيسي الأيضي ^{المفرط الاستقطاب 13}C والتصوير

الهدف العام من هذا الإجراء هو فرط استقطاب الجزيئات ذات العلامات 13 الكربونية باستخدام الاستقطاب النووي الديناميكي ، وقياس تحويلها الإيزيزمي باستخدام الرنين المغناطيسي الكربون 13 ، والتصوير المنظاري ، في المختبر. تزيد هذه الطريقة من إشارة الرنين للكربون بمقدار 10 ، 000 إلى 100 ، 000 أضعاف ، مما يسمح بتمييز المركبات ذات الطبقات عن منتجاتها الأيضية ، ووضعها في الجسم عن طريق التصوير. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة ، مقارنة بتقنيات الواقع الافتراضي ، هي أنها توفر رؤية لعملية التمثيل الغذائي للمواد التي تحدث بشكل طبيعي في الكائنات الحية في الوقت الفعلي.

أيضا ، يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لعملية التمثيل الغذائي للسرطان وكما هو الحال في المختبر. يمكن تطبيقه أيضا على النماذج الحيوانية والمرضى من البشر. يتجاوز تطبيق هذه التقنية توطين الورم.

يمكن استخدامه للعثور على الأنواع الفرعية للأورام الأيضية وتمييزها ، ومراقبة العلاج جنبا إلى جنب مع أحدث التقنيات. لبدء الإجراء ، قم أولا بإعداد محلول مليمولار واحد من الجادوترات ميجلومين ، وتركيز الكربون واحد 13 بيروفات. أضف جذر التريتيل OX063 إلى الخليط لتحقيق تركيز نهائي 15 ملليمولار ، وقم بإذابه تماما.

في برنامج DNP Polarizer ، انقر فوق Cool Down لتقليل درجة حرارة إدراج درجة الحرارة المتغيرة ، أو VTI ، أقل من 1.4 كلفن. بمجرد أن يبرد VTI ، ضع حوالي ثمانية ميكرولترات من محلول العينة الملصق بالكربون 13 في كوب عينة بلاستيكي. اربط الكوب بقضيب إدخال العينة.

في البرنامج ، انقر فوق إدراج عينة "تحديد عينة عادية" ثم "التالي" يرفع هذا حامل العينة ويفتح صمامات المدخل إلى VTI ، مما يسمح بإدخال العينة. عند المطالبة ، استخدم قضيب الإدخال لدفع كوب العينة إلى VTI. افصل كوب العينة واسحب قضيب الإدخال بعناية.

تأكد من أن العينة قد تم فصلها عن القضيب ولم يتم دفعها خارج VTI أثناء إجراء الإغلاق. انقر فوق التالي'لإغلاق الصمامات وخفض كوب العينة في الهيليوم السائل, ثم انقر فوق إنهاء'للعثور على تردد الاستقطاب الأمثل, ابدأ أولا تشغيل برنامج RINMR. في شاشة التكوين ، انقر فوق تحديد عينة "وقم بمسح صغير" قم بإنشاء الملف حيث سيتم تخزين البيانات.

ارجع إلى برنامج DNP Polarizer. حدد علامة التبويب معايرة، وقم بتعيين معلمات مسح الميكروويف، ثم ابدأ عملية مسح الميكروويف. بمجرد الانتهاء من مسح الميكروويف ، لاحظ التردد بأقصى سعة إشارة مقاسة.

ارجع إلى برنامج RINMR ، وحدد Solid Build Up "ثم ، في برنامج DNP Polarizer ، انقر فوق الاستقطاب"أدخل تردد الميكروويف الأمثل والطاقة. انقر فوق التالي"تمكين مراقبة تراكم الاستقطاب"وانقر فوق إنهاء"استقطاب العينة لفترة كافية من الوقت لتحقيق أكثر من 95٪ من الاستقطاب. أثناء الاستقطاب ، قم بتوصيل قارورة التجميع بأنبوب عادم عينة مفرط الاستقطاب ، وضعه بالقرب من مقياس الطيف.

قم بإعداد مطياف الرنين المغناطيسي النووي بتسلا واحد مع سلسلة مسح الكربون 13 من نبضات التردد اللاسلكي 110 درجة على فترات ثلاث ثوان. أثناء استقطاب البيروفات ، ابدأ في تحضير زراعة الخلايا. قم بإزالة وسط الخلية من قوارير زراعة الخلايا.

اغسل الخلايا بحوالي 10 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات. أضف خمسة ملليلتر من التربسين إلى قارورة الاستزراع. احتضان المزرعة لمدة ثلاث إلى خمس دقائق عند 37 درجة مئوية ، ثم قم بإلغاء تنشيط التربسين بحوالي خمسة ملليلتر من وسط F12K الذي يحتوي على 10٪ مصل ربلة الساق الجنينية من حيث الحجم.

بعد ذلك ، انقل حجم تعليق الخلية الذي يحتوي على العدد المطلوب من الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي بلاستيكي. الطرد المركزي عينة الخلية عند 1200 جم لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق البليت في وسط F12K كاف مع 10٪ FCS لتحقيق حجم نهائي يبلغ 800 ميكرولتر.

انقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر ، وضع الأنبوب في وعاء بلاستيكي مملوء بالماء الدافئ. لبدء جمع البيانات عبر التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي للكربون 13 ، بمجرد تحضير عينة الخلية ويكون استقطاب البيروفات أكبر من 95 بالمائة ، انقر فوق تشغيل الذوبان في برنامج DNP Polarizer. قم بتحميل الحجم المقاس لعامل الذوبان عبر الصمام العلوي لغرفة الذوبان.

حرك عصا الذوبان إلى الوضع النشط. قم بالتأكيد بالنقر فوق التالي"بمجرد أن تصبح عينة الخلية جاهزة للتجربة ، انقر فوق إنهاء" في برنامج DNP Polarizer لتهيئة عملية الحل. انتظر حتى تنتهي عملية الذوبان.

أضف 200 ميكرولتر من محلول البيروفات شديد الاستقطاب إلى 800 ميكرولتر من عينة الخلية. تخلط جيدا باستخدام ماصة ، ثم توضع حوالي 600 ميكرولتر من الخليط في أنبوب الرنين المغناطيسي النووي بطول خمسة ملليمترات. قم بتحميل أنبوب الرنين المغناطيسي النووي في مقياس الطيف وانقر فوق تشغيل لبدء القياس.

ثم ، حرك عصا الذوبان مع كوب العينة المرفق إلى موضع التنظيف وانقر فوق Finish في برنامج DNP Polarizer. لبدء التصوير بالرنين المغناطيسي للكربون 13 ، بعد بدء عملية فرط الاستقطاب ، قم بنقل 800 ميكرولتر من عينة الخلية المعاد تعليقها بعدد خلية لا يقل عن 10 إلى الثامن إلى حقنة سعة ثلاثة ملليلتر. قم بتوصيل المحقنة بقسطرة طويلة وضع المحقنة على سرير مسح التصوير بالرنين المغناطيسي.

تأكد من أن القسطرة طويلة بما يكفي للوصول إلى خارج ماسح التصوير بالرنين المغناطيسي. ضع شبح معايرة يحتوي على عشرة كربون مولي 13 يوريا مع 10٪ جادوترات ميجلومين بجوار المحقنة. ضع ملف استقبال RF مضبوطة بالكربون 13 على المحقنة.

أدخل سرير المسح الضوئي في الماسح الضوئي بحيث يكون الكائن محل الاهتمام في مركز متساوي ماسح التصوير بالرنين المغناطيسي. قم بتوصيل قارورة التوصيل بأنبوب عادم عينة مفرط الاستقطاب وضعه بالقرب من نهاية القسطرة. قم بتشغيل تسلسل توطين قياسي ثلاثي المستويات واضبط موضع المحقنة إذا لزم الأمر.

بعد ذلك ، قم بإعداد وتشغيل تسلسل تشريحي مرجح بالبروتون T2 يغطي توطين المحقنة. من الصور التشريحية الناتجة ، حدد خمس شرائح مستمرة من منطقة الاهتمام ، بما في ذلك شبح الكربون 13. قم بإعداد الحصول على معايرة طيفية للكربون 13 ، وحدد تسلسل معايرة كتلة 2D من مكتبة تسلسل النبض.

قم بتنزيل تسلسل النبض إلى الماسح الضوئي ، وقم بإجراء مسح مسبق الطيفي. في مخطط حجم الطيف ، اضبط الذروة الوهمية لمعايرة الكربون 13 على مركز تردد الماسح الضوئي. اضبط مكاسب جهاز الاستقبال على الحد الأقصى وانقر فوق Scan'لتشغيل تسلسل المعايرة.

سجل كسب الإرسال المبلغ عنه والتردد المركزي. بعد ذلك ، قم بإعداد اكتساب تصوير التحول الكيميائي للكربون 13 للشرائح التشريحية المختارة. اختر تسلسل التصوير الطيفي ثنائي الأبعاد المستوي للصدى وقم بتنزيل تسلسل النبض إلى الماسح الضوئي.

قم بتشغيل المسح المسبق الطيفي ، واضبط التردد المركزي وكسب الإرسال بناء على قيم المعايرة لإنهاء إعداد مطياف التصوير بالرنين المغناطيسي. بمجرد أن يصل البيروفات إلى 95٪ استقطاب ، انقر فوق تشغيل Dissolution في برنامج DNP Polarizer وقم بتحميل عامل الذوبان. حرك عصا الذوبان إلى الوضع النشط.

انقر فوق التالي"ثم "إنهاء"عندما تصل العينة الذائبة شديدة الاستقطاب إلى قارورة التجميع ، ارسم حوالي 1 مليلتر من محلول مفرط الاستقطاب في حقنة ، وحقنها في القسطرة بحيث يصل 200 ميكرولتر إلى عينة الخلية. انقر فوق Scan'لبدء الحصول على البيانات التجريبية. بمجرد الانتهاء من جمع البيانات ، حرك عصا الذوبان مع كوب العينة المرفق إلى موضع التنظيف ، وانقر فوق Finish في برنامج DNP NMR.

تمت دراسة معدل التبادل الأيضي للبيروفات إلى اللاكتات في خلايا PC3 لسرطان البروستاتا من خلال مراقبة كثافة إشارة التحليل الطيفي للرنين المغناطيسي النووي للكربون 13 للاكتات والبيروفات شديدة الاستقطاب فيما يتعلق بالتردد والوقت. تم تقييم القيم الحركية للاكتات من خلال نموذج نسبة بسيط ونموذج تفاضلي للتبادل من موقعين ، وتم تطبيعها وفقا لعدد الخلايا. في كلا النموذجين ، لوحظ اتجاه لتقليل إنتاج اللاكتات مع زيادة عدد الخلايا.

ويعزى ذلك إلى تركيزات أعلى للخلايا وزيادة اللزوجة للعينة. تظهر العينات التي يقل عدد الخلايا فيها عن اثنين في عشرة إلى سبعة نسبة إشارة لاكتات صغيرة جدا إلى الضوضاء وبالتالي تشير قيم انحراف معياري كبيرة إلى أن العينات يجب أن تحتوي على هذا العدد على الأقل من الخلايا للحصول على بيانات إعلامية. تم تحقيق التوطين المكاني باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي بدقة طيفية جيدة تسمح بالحصول على صور الكربون 13 لمناطق تردد محددة.

تم تحديد التوزيع المكاني من البيانات الأولية. يمكن أيضا تسجيل صورة الكربون 13 بشكل مشترك مع صورة البروتون المكتسبة سابقا. بمجرد إتقانها وإجرائها بشكل صحيح ، يمكن إجراء هذه التجربة في أقل من 60 دقيقة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء فرط الاستقطاب للجزيء المطلوب باستخدام تقنية الاستقطاب النووي الديناميكي وكيفية إجراء تجارب بسيطة للتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي وتصوير الخلايا. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تكون سريعا جدا. بعد أن تغادر العينة شديدة الاستقطاب المستقطب ، تذكر أنك تفقد كل إشارة الرنين المغناطيسي النووي المكتسبة في أقل من دقيقتين.

في الختام ، يمكن استخدام DNP الذوبان لمجموعة متنوعة من التطبيقات. يتضمن ذلك دراسة أمراض مثل مرض السكري ، أو النظر في التغيرات الأيضية لأنواع مختلفة من السرطان ، ولكن أيضا قياس درجة الحموضة الأنسجة.