مراقبة المكانية الفصل في استعمار سطح الميكروبية السكان

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة التوزيع المكاني للسلالات الميكروبية أثناء الاحتشاد أو الانزلاق أو تكوين الأغشية الحيوية باستخدام الفحص المجهري الفلوري. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الدقيقة الاجتماعي ، مثل كيفية تأثير الفصل المكاني على التفاعل الميكروبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تقييم اللياقة والتوزيع المكاني للسلالات الميكروبية بسهولة باستخدام التقنيات المجهرية وتحليل صور الأجزاء الفرعية.

ستظهر الإجراء تيريزا هولشر ، باحثة دكتوراه من مختبري. في اليوم السابق للتجربة ، أضف ثلاثة ملليلتر من وسط LB إلى أنبوب مزرعة وقم بتلقيحه من مخزون الفريزر من B.subtilis. كرر هذا التلقيح بأنبوب منفصل لكل سلالة ذات أهمية.

ضع الأنابيب في حاضنة اهتزاز أفقية عند 37 درجة مئوية طوال الليل. لتحضير الألواح لتجارب الاحتشاد والانزلاق ، اسكب 20 مل من وسط LB المقسى في طبق بتري من البوليسترين 90 ملم. أغلق الطبق على الفور وضعه على جانب واحد من الغطاء المعقم ليبرد لمدة ساعة على الأقل.

بعد ذلك ، قم بإعداد لوحات لتجارب الأغشية الحيوية للمستعمرة عن طريق صب 25 مل من أجار مرتين من وسط SG في طبق بتري 90 ملم. أغلق الأطباق على الفور واضبطها لتبرد في أكوام من أربعة أو أقل لمدة ساعة واحدة على الأقل. للبدء ، ضع ألواح LB agar المحتشبة والانزلاقية في غطاء تدفق رقائقي وقم بإزالة الأغطية.

اترك الأطباق تجف لمدة 20 دقيقة. رطوبة الألواح في هذه التجارب أمر بالغ الأهمية. بينما تسمح الرطوبة الزائدة للبكتيريا بالسباحة ، فإن التجفيف المطول يمنع الاحتشاد والانزلاق.

وبالمثل ، يعتمد هيكل الأغشية الحيوية للمستعمرة على جفاف الوسط. باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، حدد الكثافة البصرية لثقافات البداية بين عشية وضحاها عند 600 نانومتر. في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر ، قم بخلط الكثافة بكميات طبيعية من السلالات المنتجة للبروتين الفلوري الأخضر والأحمر ليصبح المجموع 200 ميكرولتر.

دوامة الأنبوب لمدة ثلاث ثوان. باستخدام ماصة دقيقة، ضع ميكرولترين من المزرعة المختلطة في وسط صفيحة أجار 90 ملم مجففة مسبقا في غطاء التدفق الرقائقي. ضع الطبق حتى يجف لمدة 10 دقائق.

أخيرا ، احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية في وضع رأسي لمنع التكثيف من التجمع على سطح الأجار. أولا ، ضع ألواح SG أجار مرتين في غطاء تدفق رقائقي لمدة 15 دقيقة حتى تجف. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر لكل من سلالة البروتين الفلوري الأخضر والأحمر الذي ينتج الأغشية الحيوية ، B.subtilis 168 مزارع البداية ، في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.

دوامة الأنبوب لمدة ثلاث ثوان. قم بإعداد الأنابيب ب 100 ميكرولتر من وسط LB وباستخدام الثقافة المختلطة ، قم بإنشاء سلسلة تخفيف 10 أضعاف من اللقاحات. باستخدام ماصة دقيقة، ضع ميكرولترين من المزرعة المختلطة غير المخففة على لوحة أجار SG مرتين.

كرر هذا مع التطعيمات ل 10 إلى واحد ، و 10 إلى اثنين ، و 10 إلى الثلاثة ، و 10 إلى التخفيفات الأربعة ، مع تباعد البقع على مسافات متساوية للسماح بزراعة ستة إلى تسع مستعمرات في طبق واحد. احتضن الألواح في وضع مستقيم عند 30 درجة مئوية لمدة يوم إلى ثلاثة أيام. للبدء ، ضع اللوحات على منصة التصوير لمجهر الكشف عن الفلورة.

بالنسبة لتجارب الانزلاق والاحتشاد ، اضبط أصل التلقيح ، منتصف طبق بتري ، على زاوية الحقل المرئي للسماح بقياس توسع المستعمرة الشعاعية. اضبط التكبير على أعلى دقة تسمح بتصوير أكبر منطقة ممكنة من اللوحة مقاس 90 ملم. اضبط وقت التعرض بشكل مناسب ، اعتمادا على قوة إشارة الفلورسنت.

لتحليل الأغشية الحيوية ، ضع مستعمرة ذات أهمية في وسط مجال الرؤية. اضبط التكبير على أعلى دقة تسمح بعرض المستعمرة بأكملها. المستعمرات جاهزة الآن للقياس والتحليل.

أخيرا ، قم بتحليل البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص. يوضح هذا الشكل نمو مستعمرة Bacillus subtilis النموذجية ذات السلالتين اللقاحتين. يؤدي الاحتشاد ، وهو حركة سطحية جماعية تعتمد على السوط إلى مختلط للغاية من السكان.

في هذا الفيديو بفاصل زمني ، تم وضع اللقاح الأولي في وسط انتشار اللوحة. لوحظ بوضوح احتشاد الطبقة الرقيقة ومع تطور المستعمرة ، تظهر السلالتان الفلوريتان الأحمر والأخضر مختلطتين ومتداخلتين. على العكس من ذلك ، تظهر صور السلوك المنزلق قطاعات محددة من النمو تتوافق مع سلالات الفلورسنت المسماة بشكل مختلف.

يظهر هذا الفيديو نمو مستعمرة منزلقة ملقحة مشتركة تفتقر فيها السلالات إلى السوط العامل. لا تزال هذه المستعمرات قادرة على الانتشار باستخدام مزيج من السكريات الخارجية المفرزة ، والهيدروفوبين ، والسورفاكتين بالسطح. تظهر المستعمرات الناتجة تشكيلة نمو مكانية مميزة مقارنة بسلالة الاحتشاد.

أثرت المستعمرات المنتجة للأغشية الحيوية التي تبدأ كثافات الخلايا بشكل كبير على التشكيلة المكانية للمستعمرات الناتجة. أظهرت المستعمرات التي بدأت بكثافة خلايا عالية من المجموعات المختلطة تشكيلة مكانية طفيفة أو معدومة. في المقابل ، عندما كانت كثافة الخلايا عند البدء منخفضة ، يمكن اكتشاف قطاعات الفلورسنت الخضراء والحمراء الصافية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد الوفرة النسبية للسلالات المصنفة بالفلورسنت في المستعمرات الميكروبية ، وفحص الفصل المكاني ، ودراسة تأثير كثافة الخلايا المؤسسة.