مراقبة المكانية الفصل في استعمار سطح الميكروبية السكان

الهدف العام من هذا الإجراء هو رصد التوزيع المكاني للسلالات الميكروبية أثناء عملية التجمهر (swarming)، أو الانزلاق (sliding)، أو تكوين الغشاء الحيوي (biofilm) باستخدام المجهر الفلوري. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال الميكروبيولوجيا الاجتماعية، مثل كيفية تأثير الفصل المكاني على التفاعل الميكروبي. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية تقييم اللياقة والتوزيع المكاني للسلالات الميكروبية بسهولة باستخدام التقنيات المجهرية وتحليل صور الأجزاء الفرعية.

ستقوم بتوضيح الإجراء ثيريزا هولشر، وهي باحثة دكتوراه من مختبري. في اليوم الذي يسبق التجربة، أضف 3 mL من وسط LB إلى أنبوب زراعة وقم بتلقيحه من مخزون مجمد لـ B.subtilis. كرر عملية التلقيح هذه في أنبوب منفصل لكل سلالة مستهدفة.

ضع الأنابيب في حاضنة هزازة أفقية عند 37 درجة مئوية طوال الليل. ولتحضير الأطباق الخاصة بتجارب التجمهر والانزلاق، صب 20 milliliters من وسط LB المعتدل في طبق بتري من البوليسترين بقطر 90 millimeter. أغلق الطبق على الفور ثم ضعه جانباً داخل غطاء التعقيم ليبرد لمدة ساعة واحدة على الأقل.

بعد ذلك، قم بتجهيز أطباق تجارب الغشاء الحيوي للمستعمرات عن طريق صب 25 milliliters من وسط SG المضاف إليه الآغار بمقدار ضعفين في طبق بتري بقطر 90 millimeter. أغلق الأطباق فوراً واتركها لتبرد في مجموعات مكونة من أربعة أطباق أو أقل لمدة ساعة واحدة على الأقل. للبدء، ضع أطباق LB agar المخصصة للتفشي والانزلاق في غطاء التدفق الصفائحي وأزل الأغطية.

اترك الأطباق لتجف لمدة 20 دقيقة. تُعد رطوبة الأطباق في هذه التجارب أمراً بالغ الأهمية؛ فبينما تسمح الرطوبة الزائدة للبكتيريا بالسباحة، فإن التجفيف المطول يمنع التجمهر والانزلاق.

وبالمثل، تعتمد بنية الغشاء الحيوي للمستعمرة على جفاف الوسط. باستخدام مقياس الطيف الضوئي، حدد الكثافات الضوئية لمزارع البدء التي نمت طوال الليل عند 600 nanometers. في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter، اخلط كميات معيرة الكثافة من السلالات المنتجة للبروتينات الفلورية الخضراء والحمراء ليصل الحجم الإجمالي إلى 200 microliters.

قم برج الأنبوب بواسطة جهاز الرج (Vortex) لمدة ثلاث ثوانٍ. وباستخدام ماصة دقيقة، ضع 2 µL من المزرعة المختلطة في مركز طبق Agar LB بقطر 90 ملم مجفف مسبقاً داخل غطاء التدفق الصفائحي. اترك الطبق ليجف لمدة 10 دقائق.

أخيرًا، يتم تحضين الأطباق عند 37 درجة مئوية في وضع رأسي لمنع تجمع التكثيف على سطح الآجار. أولاً، ضع أطباق آجار SG بتركيز مضاعف مرتين في غطاء تدفق صفائحي لمدة 15 دقيقة حتى تجف. بعد ذلك، أضف 100 µL من المزارع البادئة لسلالة biofilm المنتجة للبروتين الفلوري الأخضر والأحمر، B.subtilis 168، في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL.

قم برج الأنبوب باستخدام جهاز المزج الدوامي (Vortex) لمدة ثلاث ثوانٍ. جهّز أنابيب تحتوي على 100 µL من وسط LB الغذائي، وباستخدام المزرعة المختلطة، قم بإعداد سلسلة تخفيفات عشرية للملقحات. وباستخدام ماصة دقيقة، ضع قطرة بحجم 2 µL من المزرعة المختلطة غير المخففة على طبق آغار SG بتركيز ضعفين.

كرر هذه العملية مع اللقاحات الخاصة بتخفيفات 10¹ و10² و10³ و10⁴، مع ترك مسافات متساوية بين النقاط للسماح بنمو ست إلى تسع مستعمرات في الطبق الواحد. حضن الأطباق في وضع رأسي عند 30 °C لمدة تتراوح من يوم واحد إلى ثلاثة أيام. للبدء، ضع الأطباق على منصة التصوير الخاصة بمجهر الكشف الفلوري.

في تجارب الانزلاق والتجمهر، ضع نقطة التلقيح، وهي منتصف طبق بتري، عند زاوية المجال المرئي للسماح بقياس التوسع الشعاعي للمستعمرة. اضبط التكبير على أعلى دقة تسمح بتصوير أكبر منطقة ممكنة من الطبق الذي يبلغ قطره 90 مليمتر. اضبط وقت التعرض بشكل مناسب، اعتماداً على قوة الإشارة الفلورية.

لتحليل الغشاء الحيوي، ضع المستعمرة المطلوب دراستها في مركز مجال الرؤية. اضبط التكبير على أعلى دقة تتيح رؤية المستعمرة بأكملها. المستعمرات الآن جاهزة للقياس والتحليل.

وأخيراً، قم بتحليل البيانات كما هو موضح في البروتوكول النصي. يوضح هذا الشكل نمو مستعمرة نموذجية من بكتيريا *Bacillus subtilis* تم تلقيحها بسلالتين معاً. ويؤدي التجمهر (Swarming)، وهو حركة سطحية جماعية تعتمد على السوط، إلى تكوين مجتمع بكتيري مختلط للغاية.

في هذا الفيديو بنظام التصوير المتقطع (time-lapse)، وُضع اللقاح الأولي في مركز الطبقة المنشورة على الطبق. يُلاحظ بوضوح حدوث تجمهر في طبقة رقيقة، ومع تطور المستعمرة، تظهر السلالتان الفلوريسنتيتان الحمراء والخضراء مختلطتين ومتداخلتين. وفي المقابل، تُظهر الصور الخاصة بسلوك الانزلاق قطاعات نمو محددة تتوافق مع السلالات الفلوريسنتيتة ذات العلامات المختلفة.

يعرض هذا الفيديو نمو مستعمرة مشتركة التلقيح منزلقة تفتقر سلالاتها إلى أسواط وظيفية. لا تزال هذه المستعمرات قادرة على الانتشار باستخدام مزيج من السكريات المتعددة الخارجية المفرزة، والهيدروفوبين، والسورفاكتين. وتظهر المستعمرات الناتجة توزيعاً نموياً مكانياً متميزاً مقارنة بالسلالة التي تتميز بالحركة الجماعية (swarming).

أثرت الكثافات الخلوية الأولية للمستعمرات المنتجة للغشاء الحيوي بشكل كبير على الترتيب المكاني للمستعمرات الناتجة. فأظهرت المستعمرات التي بدأت بكثافة خلوية عالية من المجموعات المختلطة ترتيباً مكانياً طفيفاً أو معدوماً. وفي المقابل، عندما كانت الكثافة الخلوية عند البدء منخفضة، أمكن اكتشاف قطاعات فلورية خضراء وحمراء واضحة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد الوفرة النسبية للسلالات الموسومة فلوروسنتياً في المستعمرات الميكروبية، وفحص الفصل المكاني، ودراسة تأثير كثافة الخلايا المؤسسة.