الهجين قطع: طريقة محسنة باجتزاء لعينات الأنسجة النباتية المتمردة

الهدف العام لطريقة تقسيم الأنسجة المقطوعة الهجينة هو تحسين سلامة الأنسجة النباتية المتمردة المقطعة ، تلك التي تحتوي على ألياف صلبة وبلورات السيليكا ، لإنشاء عينات أنسجة مناسبة للدراسات التشريحية والبيولوجية. يمكن أن تعاني النباتات التي تحتوي على مستوى عال من الكريستال والسيليكا من تمزق البارافين الشديد ومشكلة أثناء التقسيم. هذه الطريقة تحسن بشكل كبير من سلامة الأنسجة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن التقسيم تحت درجة حرارة منخفضة للغاية في ناظم البرد يقوي كتلة البارافين ، مما يقلل بشكل كبير من مشكلة قص البلورات. يمكن أن يمتد تطبيق هذه التقنية إلى التهجين في الموقع ، FISH ، والتقييم الداخلي من بين أمور أخرى. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن الخطوات اللازمة لضمان الالتزام بإحكام بكتلة البارافين في مرحلة ما يمكن أن تكون صعبة.

للبدء ، اختر نباتات الأوركيد الناضجة فالاينوبسيس في مرحلة الأوراق الخمسة. قم بإزالة الأوراق بعناية عن طريق تمزيقها على طول منتصف الضلع. باستخدام مشرط حاد ، قم بإزالة البراعم الإبطية بعناية من قاعدة الورقة الثالثة أو الرابعة على نظام أحادي القدم.

ضع العينات على الفور في قارورة زجاجية تحتوي على 15 مل من مثبت PFA المثلج. ضع فراغا على العينات في المثبت عند أربع درجات مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة. سيتم إطلاق فقاعات صغيرة من العينات.

كرر هذه الخطوة حتى تغرق معظم العينات بعد تحرير الفراغ. أخيرا ، احتفظ بالمكنسة الكهربائية طوال الليل وحررها ببطء في اليوم التالي. بعد ذلك ، اغمر العينات الثابتة في 15 مل من PBS وضعها على الجليد لمدة 15 دقيقة.

تجفيف العينات في 15 مل من الإيثانول في سلسلة من التركيزات المتزايدة. 30٪ 50٪ 70٪ 85٪ 95٪ وأخيرا 100٪ تسلل العينات ب 15 مل من حجم اثنين إلى واحد لحجم خليط بديل للإيثانول والزيلين في درجة حرارة الغرفة. استمر في التسلل عن طريق وضع العينات بالتتابع في 15 مل من كل مما يلي.

خليط من حجم إلى حجم من بديل الإيثانول والزيلين ، ومزيج من حجم إلى حجم من بديل الإيثانول والزيلين ، وأخيرا ، بديل الزيلين النقي. ثم احتضان المناديل في فرن على حرارة 60 درجة مئوية. تسلل العينات ب 15 مل من بديل الزيلين وخليط البارافين عند 60 درجة مئوية.

أخيرا ، تسلل البارافين في 15 ملم من البارافين النقي مرتين لمدة 12 ساعة لكل منهما عند 60 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة في اليوم التالي. لبدء التضمين ، قم أولا بتسخين القوالب المعدنية إلى 62 درجة مئوية ، ثم صب ما يقرب من 13 مل من الشمع المنصهر في قاعدة القالب.

باستخدام ملقط دافئ ، انقل عينة من الأنسجة إلى القالب ووجهها إلى الموضع المطلوب. حرك القالب بعناية على لوحة التبريد واتركه يقف حتى يتجمد الشمع. بعد ذلك ، استخدم شفرة حلاقة لقص كتلة عينة البارافين إلى عمود بحجم مناسب مع سطح شبه منحرف في الأعلى.

أضف 800 ميكرولتر من مركب درجة حرارة القطع البصري ، أو OCT ، إلى مركز مرحلة ناظم البرد. ضع كتلة البارافين على المسرح ، وقم بتوجيه كتلة الأنسجة بسرعة إلى الموضع المطلوب. انقل كتلة البارافين والمرحلة إلى غرفة الكريستات.

قم بتجميد OCT بسرعة عند سالب 42 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتبريد محول crystat ودرجة حرارة الغرفة إلى سالب 20 درجة مئوية وسالب 16 درجة مئوية على التوالي. قم بتوصيل الكتلة والمرحلة بمحول crystat.

الآن ، قم بتقسيم الأنسجة إلى سمك 10 ميكرومتر. باستخدام الملقط ، التقط أقسام الأنسجة وضعها بحيث تطفو على 800 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC على شريحة مطلية ب poly-l-lysine. انقل الشرائح إلى طبق ساخن مضبوطة على 42 درجة مئوية.

اسمح للأقسام بالتسطيح واستخدم ورق الترشيح لامتصاص أي ماء من الحواف. اترك العينة على اللوح الساخن عند 42 درجة مئوية طوال الليل للسماح للأنسجة بالتركيب على الشريحة. لإزالة العينات ، ضع أولا شرائح الأنسجة المثبتة في رف تلطيخ.

أضف 150 مل من الزيلين في وعاء تلطيخ ، واغمر رف الشرائح لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، أعد ترطيب العينات عن طريق وضعها في تركيزات متناقصة من الإيثانول ، 150 مل لكل منها لمدة ثلاث دقائق في المرة الواحدة في درجة حرارة الغرفة. أخيرا ، اغمر العينات في الماء المقطر المزدوج لمدة ثلاث دقائق.

تلطيخ العينات عن طريق وضع الشرائح في 150 مل من محلول الهيماتوكسيلين لمدة 1.5 دقيقة. اشطف لبضع ثوان في 150 مل من الماء المقطر المزدوج الذي يحتوي على قطرة إلى قطرتين من حمض الهيدروكلوريك N ، ثم اغسل الشرائح لفترة وجيزة بالماء المقطر المزدوج. قم بتجفيف العينات مرة أخرى باستخدام سلسلة من 150 مل من تركيزات الإيثانول المتزايدة لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.

اغمر العينات في 150 مل من الزيلين لمدة خمس دقائق. أخيرا ، قم بتركيب العينات عن طريق إضافة 600 ميكرولتر برفق من وسط التثبيت القائم على الزيلين على كل شريحة ، ثم وضع زلة غطاء فوق العينة. باستخدام هذه الطريقة ، تم إنشاء أقسام من أنسجة بساتين الفاكهة فالاينوبسيس ، بما في ذلك البرعم الإبطي الذي يصعب تقسيمه عادة ، والذي يحتوي على مستويات عالية من البلورات.

تم الحفاظ على الهياكل التفصيلية ، مما يسمح بتصور أجسام البروتين. أنتج القطع الهجين أيضا قسما واضحا لتصور النسيج الإنشائي القمي للبذرة النابتة. تظهر هذه الصور تحضير مقاطع الأوراق المستعرضة لنباتات الأرز والقمح باستخدام تقنيات التقسيم التقليدية للبارافين مقابل تقنيات التقطيع الهجينة.

هذه المحاصيل عادة على مستويات عالية من السيليكا ، مما يجعل من الصعب تقسيمها. تم تحسين سلامة الأنسجة في أقسام القطع الهجينة بشكل كبير ، وتم الحفاظ على الهياكل الرئيسية المشوهة في كثير من الأحيان ، أو يصعب العثور عليها في عينات البارافين ، بالكامل في الأنسجة المقطوعة الهجينة. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ التمزق فقط في عينات البارافين المقطعة.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن الاحتفاظ القوي بالتشريح يجعل الأنسجة المقطوعة الهجينة مفيدة لدراسات أنماط التعبير الجيني المكاني. هنا ، تم إجراء التهجين في الموقع مع Actin و Cyclin B1: 1 على أقسام القطع الهجينة من البراعم الإبطية الثانية والثالثة من بساتين الفاكهة فالاينوبسيس. سمح الحفظ التشريحي المحسن بالكشف عن مستويات التعبير الأعلى للجينات المستهدفة في الخلايا الإنشائية النامية للبراعم الإبطية الثالثة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم الحفاظ على درجة حرارة عند 16 درجة مئوية تحت الصفر لتقوية كتلة البارافين. يجب أن يؤدي هذا إلى قسم أنسجة عالي الجودة. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة بعد أن فشلنا عدة مرات في إجراء التقسيم الناجح في الأوركيد باستخدام طريقة البارافين التقليدية أو القطع بالتبريد.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء جميع التجارب مثل التهجين في الموقع و FISH من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، بما في ذلك التحقيق في التوطين المكاني للجينات ووظيفتها. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تقسيم الأنسجة عالي الجودة في عينة نبات متمردة.