إنتشار الجزيئي في أغشية البلازما الخلايا اللمفاوية الابتدائية تقاس الإسفار الارتباط الطيفي

الهدف العام من هذا البروتوكول هو قياس معدل انتشار البروتين المسمى في أغشية الخلايا المناعية الأولية باستخدام التحليل الطيفي لارتباط التألق. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحديد الأسئلة الرئيسية في مجالات علم المناعة وبيولوجيا الخلية ، مثل تحديد الخلايا القاتلة الطبيعية ذات ديناميكيات مستقبلات الغشاء الأكثر نشاطا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم مع الخلايا الحية ، لذا فهي تعكس بدقة الحالة الطبيعية لكيفية تحرك الجزيئات.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو العلاج المناعي للسرطان إذا كانت سمات الخلايا القاتلة الطبيعية المختلفة ، مثل الانتشار الجزيئي ، مرتبطة بوظيفتها بحيث يمكن التنبؤ بالكفاءة بشكل أفضل. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للحركة الجزيئية في الخلايا المناعية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الخلايا الأولية الأخرى وخطوط الخلايا في أي تخصص. افتح البرنامج في وضع الخبراء، مع تحديد الخيار مسح صور جديدة ضوئيا.

حدد عدسة الهدف المائي 40X على مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر. ضمن علامة التبويب اكتساب، اضغط على زري التكوين والمسح الضوئي لفتح عنصر التحكم في التكوين وعنصر التحكم في المسح. ضمن علامة التبويب ConfoCor ، اضغط على قياس لفتح نافذة القياس.

بعد ذلك ، قم بإنشاء مجلد لحفظ قياسات FCS. ابدأ قاعدة بيانات صور جديدة بالنقر فوق جديد ضمن علامة التبويب ملف. قم بتشغيل مصباح الهالوجين.

باستخدام زر الليزر ، قم بتشغيل الليزر ذي الصلة لإثارة الفلوروفور. ثم حدد إعدادات التقاط الصورة في نافذة التحكم في التكوين. يتضمن ذلك ليزر الإثارة ومرشحات الإثارة والانبعاث ومسار الضوء وأجهزة الكشف المستخدمة.

وبالمثل ، انتقل إلى نافذة القياس واضبط إعدادات FCS ضمن علامة التبويب تكوين النظام. قم بتنشيط قنوات الكشف لتسجيلات FCS عن طريق تبديل Ch 1 للقناة الخضراء ، و Ch 2 للقناة الحمراء. أثناء استقرار الليزر ، والذي قد يستغرق ما يصل إلى 30 دقيقة ، اضبط الثقب.

أولا ، ضع قطرة 50 ميكرولتر من الصبغة مركزيا في بئر واحد من شريحة زجاجية ذات غرف من ثماني آبار مطلية ب poly-L-lysine. تستخدم الآبار المجاورة لإجراء قياسات الخلية حيث تعتمد المعايرة على الشريحة. ضع قطرة من الماء المقطر على العدسة ذات الهدف المائي 40X وضع الشريحة.

ثم اضغط على Vis لتحديد مصدر الضوء المرئي والتركيز على الموضع المركزي لقطرة الفلوروفور. في نافذة قياس البرنامج، حدد علامة التبويب الاستحواذ وضمن المراكز، قم بتبديل المركز الحالي. ثم ارجع إلى علامة التبويب "تكوين النظام" في نفس النافذة ، وقم بتعيين طاقة عالية أو مشبعة لليزر الأخضر.

لاختبار استقرار الإشارة، اضغط على ابدأ لفتح نافذة جديدة تعرض منحنى تتبع الوقت والارتباط التلقائي. تأكد من أن إشارة الفلورسنت عالية ومستقرة وأن المحور y يظهر تذبذبا في نطاق الكيلو هرتز. قد تكون القيم المنخفضة بسبب التركيز غير الدقيق أو تدهور الصبغة.

بعد ذلك ، في نافذة القياس ، حدد الزر O ضبط. ثم حدد قناة الكشف الصحيحة واضغط على ضبط تلقائي X.إذا كان الحد الأعلى للمنحنى الناتج مفقودا أو غير في المنتصف ، فحدد الخيار خشن واضغط على ضبط تلقائي X مرة أخرى. بعد ضبط اتجاه X ، افعل الشيء نفسه مع اتجاه Y بالضغط على ضبط تلقائي Y.قم بإلغاء تحديد Coarse والتبديل بين ضبط X و Y بالضغط على ضبط تلقائي حتى يكون لكل منهما قيم قصوى واضحة وثابتة.

إذا كانت الخلايا مصنفة بواسطة اثنين من الفلوروفورات المختلفة ، أضف قطرة من محلول الفلوروفور الأحمر إلى غرفة مجاورة. ثم قم بمعايرة القناة الثانية. اضبط الليزر الأحمر على طاقة عالية ، وكرر إجراء معايرة الثبات.

بعد ذلك ، نقيس وقت عبور الفلوروفورات المنتشرة بحرية من خلال التركيز. ونستخدم المرحلة بعد ذلك لحساب مساحة غشاء الخلية الموجودة داخل البؤرة. للبدء ، ركز على قطرة من المحلول من خلال تنفيذ إجراء الضبط بعناية.

ثم انتقل إلى علامة التبويب "اكتساب" في نافذة "القياس" واضبط وقت الاستحواذ على 30 ثانية بثلاث تكرارات. اضبط طاقة الليزر على ما يقرب من التشبع واضغط على ابدأ لإجراء القياس. سجل التعداد لكل جزيء أو CPM بعد اكتمال القياس.

ثم قم بإجراء قياسات جديدة لإجراء تخفيضات متكررة في طاقة الليزر. ضمن نطاق الطاقة هذا ، قم بتضمين القوة المتوقعة لقياسات الخلية القادمة. تحقق بعد ذلك من أن قيم CPM تتناسب خطيا مع طاقة الليزر.

شريطة أن يكون باقي المقياس خطيا ، فإن التشبع بأعلى قوة مقبول. في المرة الأولى التي يتم فيها استخدام جسم مضاد فلوري مترافق حديثا ، قم بإجراء قياس FCS للأجسام المضادة المنتشرة بحرية لتحديد كمية CPM المتوقعة. ومن المهم استخدام الآبار المطلية ب PEG Poly-L-Lysine للحصول على أجسام مضادة مجانية.

لهذا الإجراء ، قم بتغطية شريحة ذات حجرة ب 200 ميكرولتر من Poly-L-Lysine المطعمة بالبولي إيثيلين جلايكول. دع المحلول يلتصق لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. يمكن تبريد محلول المرق لمدة تصل إلى أسبوعين.

ويجب تخزين مخزون المسحوق في الفريزر. في وقت لاحق ، قم بإزالة السائل واترك الغرفة تجف في الهواء. في المجهر ، قم بتخفيف الجسم المضاد في PBS إلى ما بين واحد و 10 ميكروغرام لكل ملليلتر.

تابع قياس وقت عبور الأجسام المضادة الحرة كما هو موضح في القسم السابق للفلوروفورات الحرة. لأخذ القياس في الخلية ، أضف 125 ميكرولترا من الخلايا في PBS بالإضافة إلى 1٪ FCS من تعليق الخلية المسمى بالأجسام المضادة. و 150 ميكرولترا من معهد روزويل بارك التذكاري الشفاف متوسط 1640 في بئر فارغ في الشريحة الزجاجية المطلية ب PLL.

دع الخلايا تحتضن في الظلام عند درجة حرارة القياس لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل المتابعة ، حتى تتمكن الخلايا من الالتصاق والتوازن. ابدأ التصوير بفحوصات XY السريعة للعثور على أقل طاقة ليزر ممكنة اللازمة لعرض الخلايا. ثم قم بتوسيط الصورة على خلية مستديرة ذات سطوع متوسط حيث يتم تعريف الغشاء بوضوح.

من الأهمية بمكان عدم وجود إشارة فلورية في السيتوبلازم. قم بالتكبير حتى تغطي الخلية معظم الصورة. ثم ركز على الجزء العلوي من غشاء الخلية.

ابدأ من وسط الخلية وتحرك لأعلى حتى يظهر مركز الصورة مساحة مستديرة صغيرة مع تألق متساو. يعد وضع التركيز بعناية أمرا بالغ الأهمية. إذا لم يكن التركيز في الغشاء ، فلن يأتي التألق المكتشف من مستقبلات الغشاء ذات العلامات الفلورية.

وبالتالي لن تعكس النتائج سلوكهم. الآن ضمن علامة التبويب Acquisition في نافذة Measurement ، حدد موضعا لقياس FCS عن طريق تنشيط Crosshair. ثم اضبط عدد التكرارات على ما بين ستة و 10 واضبط قياس الوقت على 10 ثوان لكل تكرار.

عد الآن إلى علامة التبويب تكوين النظام في نافذة القياس وقم بخفض طاقة الليزر لقياسات FCS إلى ما بين واحد و 10 ميكرووات. ثم اضغط على ابدأ. إذا انخفض تتبع الشدة بأكثر من 30٪ خلال أول 10 ثوان ، تبييض الخلية كثيرا ويجب قياس خلية أخرى بقوة أقل.

في حالة فقد الإشارة ، اضبط التركيز في الاتجاه Z وأعد القياس. بعد اكتمال القياس، انظر في نافذة التحكم في المسح الضوئي للتحقق من أن الخلية لا تزال في المنتصف للتأكد من قياس غشاءها. إذا تم نقل الخلية، فتجاهل البيانات.

انتقل الآن إلى الارتباط التلقائي نافذة واحذف التكرارات الفردية التي تحتوي على مناورات التكبير/التصغير أو التبييض أو المجموعات الكبيرة أو القطع الأثرية الأخرى يدويا. استخدم النقر بزر الماوس الأيمن وحدد حذف لإزالة البيانات الاصطناعية. يتطلب اختيار القطع الأثرية الفعلية ممارسة.

تعد إزالة التكرارات عملية بسيطة ، ولكن يجب تقييم التكرارات بشكل صحيح لمعرفة ما يجب إزالته وأيها لا ينبغي إزالته. ثم احفظ الملف النهائي بتنسيق FCS. احتفظ فقط بالخلايا التي لم يتبق لها سوى أربعة تكرارات على الأقل بعد إزالة القطع الأثرية لمزيد من التحليل.

منحنى الارتباط التلقائي لمستقبلات الغشاء النموذجية سلس وله وقت عبور يتراوح من 10 إلى 400 مللي ثانية. اضبط المجالات المناسبة بحيث يتم تمثيل كل من بداية ونهاية الجزء المنحدر الأكثر انحدارا ، والذي يمثل الانتشار. باستخدام نموذج الانتشار الحر في بعدين ليناسب البيانات ، انتبه إلى الجزء الأكثر انحدارا من المنحنى.

التقلبات الصغيرة عند أو حوالي ثانية واحدة على مقياس تاو ، والتي تظهر في المقياس المتبقي ، مقبولة. إذا كان المنحنى مناسبا بشكل سيء ، ولكن الخلية لا تعاني من مشاكل واضحة ، مثل الحركة أو التبييض أو المجموعات ، فمن المحتمل أن تحتاج قيم البداية أو الحدود العليا والسفلية للنموذج إلى التغيير. بمجرد أن يتناسب النموذج بشكل جيد مع منحنى الارتباط التلقائي ، استخرج قيم المعلمات المتغيرة.

يمكن أن يتراوح عدد الجزيئات بين 0.5 إلى حوالي 200 لكل ميكرون مربع للبروتينات المعبر عنها داخليا. تأكد من أن قيمة CPM من قياس الخلية لا تقل عن 33٪ من تلك المسجلة من الأجسام المضادة المنتشرة بحرية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس معدل انتشار البروتينات باستخدام التحليل الطيفي للارتباط الفلوري.

بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون خمس إلى ست ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم إبقاء الخلايا على الجليد حتى حوالي 20 دقيقة قبل بدء القياس. لا تقيس أي عينات لأكثر من ساعتين.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التصوير من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل كيفية ارتباط معدل الانتشار بمستوى التعبير عن بروتين معين. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات البيولوجيا الجزيئية وعلم المناعة لاستكشاف ديناميكيات البروتينات في الخلايا الحية.