وغير المباشرة العصبية نجمية Coculture الفحص: هناك في المختبر مجموعة المتابعة للتحقيق مفصل من التفاعلات العصبية، الدبقية

الهدف العام من اختبار الزراعة المشتركة غير المباشر هذا هو التحقيق في تأثير الخلايا النجمية على تطور الخلايا العصبية. يهتم مختبرنا بدور تفاعلات الخلايا العصبية الدبقية. يعتقد أن الخلايا النجمية تساهم في تكوين نقاط الاشتباك العصبي ، وهي الهياكل المتصلة للجهاز العصبي المركزي.

من أجل دراسة دورهم ، قمنا بتصميم نموذج في المختبر حيث يمكننا الجمع بين الخلايا النجمية الأولية والخلايا العصبية الجنينية الأولية ، في مقصورات منفصلة. ترتبط المقصورات بغشاء قابل للاختراق ، مما يسمح بتحليل التبادلات بين كلا النوعين من الخلايا. باستخدام هذا النهج ، تمكنا من مراقبة تكوين المشبك على مدى فترات تصل إلى أربعة أسابيع.

بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن التحقيق في الأدوار الفردية للخلايا النجمية من ناحية ، والخلايا العصبية من ناحية أخرى ، باستخدام هذا الفحص. وأخيرا، يمكننا أيضا أن نبحث بمزيد من التفصيل عن إفراز حجرات الخلايا التي تحتوي على جزيئات تتوسط التأثير المتبادل لكلا الحجرتين الخلويتين في هذا النظام. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للتفاعلات بين الخلايا العصبية والخلايا النجمية.

أيضا ، يمكن تطبيقه على الكائنات الحية النموذجية الأخرى ، مثل خلايا الفئران. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن الخبرة مطلوبة للحصول على عملية النضج المثلى لأنسجة الحصين بعد التشريح. لتشريح القشرة ، قم بإزالة الجلد من الجمجمة على طول خط الوسط بدءا من الرقبة إلى مستوى العينين.

بعد ذلك ، أمسك الرأس من الطرف المنقاري بزوج من الملقط وقم بعمل شق على طول خط الوسط للجمجمة. ثم قم بقص النصفين الأيسر والأيمن من الجمجمة لكشف الدماغ. بعد ذلك ، ارفع الدماغ من الجمجمة وانقله إلى طبق بتري مقاس 10 سم مليء ب HBSS.

استمر بنفس الطريقة مع العينات المتبقية حتى يتم جمع جميع الأدمغة في الطبق. لفصل القشرة ، اضغط على الجزء الخلفي باستخدام زوج من الملقط. قم بعمل شق خط الوسط بين نصفي الكرة الأرضية.

قم بإصلاح الدماغ بعناية وقطع الدماغ المتوسط والبصلة الشمية باستخدام زوج ثان من الملقط ، مما ينتج عنه نصفين قشريين. بعد ذلك ، قم بإصلاح نصف قشري واحد بزوج واحد من الملقط وقشر السحايا عن طريق فصله عن الحافة الجانبية. وبعد ذلك سحبها من السطح القشري باستخدام زوج ثان من الملقط.

قم بتوجيه النصف القشري بحيث يكون سطحه متجها لأسفل. قم بتشريح وإزالة الحصين على شكل هلال بعناية. ثم انقل القشرة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.

أضف مل واحد من الدنيم و 0.1٪ غراء بالوزن الوزني إلى أنبوب تفاعل سعة 2 مل. احتضان المعلق في حمام مائي عند 37 درجة مئوية حتى يصبح المحلول صافيا. أضف L-cysteine و DNAse إلى الخليط ورجه برفق.

بعد ذلك ، قم بتصفية الخليط للحصول على مل واحد من المحلول المعقم ، ثم أضفه إلى الأنسجة القشرية واحتضانه لمدة 30 دقيقة إلى ساعة عند 37 درجة مئوية. لإنهاء تفاعل الهضم ، أضف مل واحد من وسط الخلايا النجمية وقم بمعايرة الأنسجة المهضومة بعناية. بعد ذلك ، أضف خمسة مل من وسط الخلايا النجمية إلى تعليق الخلية.

بمجرد تفكيك الأنسجة في معلق خلية واحدة ، قم بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بشفط المادة الطافية بعناية من الحبيبات الناتجة وأعد تعليق الخلايا في مل واحد من وسط الخلايا النجمية. أضف تعليق الخلية إلى قوارير T75 التي تم تجديدها بتسعة مل من وسط الخلايا النجمية.

بعد سبعة أيام من الثقافة ، تحقق مما إذا كانت الخلايا قد شكلت طبقة أحادية التقاء. تأكد من ضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية وأن مرشح القارورة مغلق بغشاء مختبر لمنع تبخر ثاني أكسيد الكربون. من أجل التخلص من الخلايا السلفية والحصول على ثقافة الخلايا النجمية النقية ، ضع قوارير T75 على شاكر مداري وهز الثقافات طوال الليل بمعدل 250 دورة في الدقيقة.

في اليوم التالي ، استنشق الوسط وأضف 10 مل من وسط الاستزراع الطازج الذي تم تجديده ب 20 ميكرومولار RSE للتخلص من الخلايا المنقسمة المتبقية. في هذا الإجراء ، ضع أكبر عدد ممكن من الإدخالات حسب الحاجة في لوحة 24 بئر. قم بتغطية كل ملحق ب 10 ميكروغرام لكل مل من بولي ديليسين واحتضانه لمدة ساعة واحدة.

بعد ساعة واحدة ، اغسل الإدخالات مرتين باستخدام PBS. في غضون ذلك ، قم بشفط وسط الخلايا النجمية وغسل المزرعة مرة واحدة باستخدام 10 مل من PBS لضمان إزالة المصل المتبقي. بعد ذلك ، أضف ثلاثة مل من 0.05٪ تريبسين إدتا إلى القوارير واحتضان الخلايا للتربسين لمدة 10 دقائق تقريبا.

بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا برفق في سبعة مل من وسط الخلايا النجمية. انقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق عند 216 × جم. ثم قم بشفط المادة الطافية بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية في مل واحد من وسط الخلايا النجمية.

عد الخلايا باستخدام غرفة العد. بعد ذلك ، املأ لوحة 24 بئر ب 500 ميكرولتر من وسط الخلايا النجمية لكل بئر. استنشق PBS ونقل 25,000 خلية و 500 ميكرولتر من وسط الخلايا النجمية إلى كل إدخال فردي واحتضان الثقافة عند 37 درجة مئوية.

لتشريح الحصين ، قم بإعداد ثلاثة أطباق مقاس 10 سم مليئة بوسط التحضير وأنبوب واحد بحجم 2 مل مع مل واحد من وسط التحضير. قم بتشريح الحصين من قشرة القشرة واجمعها في أنبوب مللي مملوء بوسط التحضير. من الأهمية بمكان عزل الحصين بدون نسيج مجاور من مناطق أخرى من الجهاز العصبي المركزي.

لذلك ، بعد إزالة الحصين ، يجب إزالة الأنسجة الملوثة الأجنبية بشكل إضافي. بعد التشريح ، انقل الأنبوب إلى مقعد تدفق رقائقي معقم. قم بإزالة وسط التحضير بعناية وهضم أنسجة الحصين من مل واحد من محلول الهضم الذي يحتوي على غراء.

بعد 15 دقيقة من الهضم ، اسحب محلول الهضم بعناية عن طريق الشفط اللطيف باستخدام الماصة. نظرا للحساسية العالية للخلايا العصبية ، من الأهمية بمكان معايرة الحصين بعناية لتجنب الفقاعات والحصول على شدة المعايرة بالتحليل الحجمي المثلى. اغسل الحصين ثلاث مرات بوسط الخلايا العصبية عن طريق إضافة وشفط مل واحد بعناية من وسط المزرعة الطازجة لكل دورة غسيل.

بعد خطوة الغسيل النهائية ، قم بمعايرة الأنسجة بعناية في مل واحد من وسط الخلايا العصبية. ثم عد الخلايا باستخدام غرفة العد. لوحة 35 ، 000 خلية في 500 ميكرولتر من وسط الخلايا العصبية لكل بئر من لوحة 24 بئر واحتضان الخلايا العصبية عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

الآن خذ الإدخالات المعدة ، والتي تم زرعها بطبقات أحادية من الخلايا النجمية المتقاربة من الحاضنة. استبدل الوسط عن طريق شفط وسط الخلايا النجمية واستبداله ب 500 ميكرولتر من وسط الخلايا العصبية الطازجة. ثم ضع الإدخالات مع الخلايا النجمية بعناية في الآبار التي تحتوي على مزارع الخلايا العصبية باستخدام ملقط معقم.

بعد ذلك ، ضع الزراعة المشتركة للخلايا النجمية العصبية غير المباشرة الناتجة مرة أخرى في الحاضنة حتى التجارب. تظهر هذه الصورة الطبقات الأحادية التي تشكلها الخلايا النجمية على غشاء إدراج ثقافة الخلايا. الخلايا النجمية ملطخة بالمناعة ل GFAP و MMP2.

المخطط هنا إعداد الزراعة المشتركة غير المباشر. على الرغم من أن ثقافتين منفصلتين جسديا ، إلا أنهما تشتركان في نفس الوسيط. يتم الكشف عن اثنين من الوسطاء الجزيئيين المفرزين لتفاعلات الخلايا الدبقية العصبية في وسط الزراعة المشتركة باستخدام اللطخة الغربية مع أشكال إسوية متعددة من TNC ، منظم نمو مباشر و MMP2 ، معدل مصفوفة خلوية إضافية.

توضح هذه الصورة أن الخلايا العصبية الأولية تطور شبكات مترابطة للغاية بحلول اليوم 14 من الزراعة. يوثق التوطين المشترك للباسون قبل المشبكي مع سقالات PSD95 بعد المشبكي التكوين المشبكي المكتمل هيكليا. في الختام ، باستخدام نظام الفحص الخاص بنا ، أظهرنا أنه من الممكن الجمع بين الخلايا النجمية الأولية والخلايا العصبية الأولية في نموذج الزراعة المشتركة.

كلا النموذجين منفصلان ولكنهما يشتركان في نفس الوسيط. وبالتالي ، يمكننا أيضا التحقيق في سكرتيوم كلا النوعين الظاهريين في نموذجنا. في هذا النموذج ، تتطور نقاط الاشتباك العصبي وتنضج.

علاوة على ذلك ، يمكننا أيضا إظهار ظهور هياكل محددة إضافية مثل الشباك المحيطة بالعصب. وبالتالي ، فإن نظامنا النموذجي مناسب تماما للتحقيق في تأثير الخلايا النجمية على تكوين المشبك واللدونة والوظيفة.