زيكا الفيروسات نظام المعدية خلية الثقافة و

الهدف العام من هذه الدراسة هو إنشاء نظام استزراع مخبري لفيروس Zika يعتمد على خلايا ثديية لدراسة تضاعف فيروس Zika، بالإضافة إلى استخدام هذه المنصة المخبرية في تطوير الأدوية. يمكن لهذا البروتوكول التفصيلي والتدريجي لنظام استزراع خلايا مصابة بفيروس Zika أن يساعد في معالجة آلية إمراض المرض الذي يتوسطه فيروس Zika وتطور الضراوة الفيروسية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح بإنتاج فيروس Zika على نطاق واسع من أجل تطوير الأدوية واللقاحات.

ابدأ بحصد خلايا Vero عند كثافة خلوية تبلغ 80% في دورق زراعة T75 عن طريق شفط الوسط من الدورق وشطف الخلايا بملليلترين من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات. أضف ملليلترين من التريبسين بتركيز 0.25% واحضن الدورق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد فترة الحضن، أضف ثمانية ملليلترات من وسط النمو الذي يحتوي على المصل لإبطال مفعول التريبسين. بعد ذلك، انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر. ثم، اسحب 10 ميكرولتر من الخلايا واخلطها بكمية مساوية من صبغة trypan blue بتركيز 0.4%. قم بتحميل الخليط المجهز على شريحة غرفة عد الخلايا واحصل على عدد الخلايا الحية باستخدام عداد خلايا آلي. ازرع إجمالي سبعة ملايين خلية في دورق T160 في حجم 30 ملليلتر. وفي اليوم التالي، قم بتجهيز تعدد عدوى مناسب من ملقح فيروس Zika في 10 ملليلتر من وسط زراعة خالٍ من المصل لكل دورق.

يُعد التعامل الآمن مع الفيروس أمراً بالغ الأهمية لمنع انتشار العدوى.

قم بإزالة الوسط المستنفد من قارورة T160، ثم أضف 10 milliliters كاملة من اللقاح الفيروسي المُحضّر حديثًا. حضن القوارير الملقحة عند 37 درجة مئوية مع 5%CO2 لمدة تتراوح من أربع إلى ست ساعات. قم بتوزيع اللقاح عن طريق إمالة القارورة برفق نحو الجوانب كل ساعة من ساعات التحضين. عند اكتمال فترة التحضين، استبدل اللقاح بـ 30 milliliters من وسط نمو دافئ مدعّم بالمصل. بعد ذلك، استمر في استزراع الفيروس لمدة 96 ساعة القادمة. بعد مرور أربعة أيام، تحقق من تطور العدوى من خلال ملاحظة ظهور اللويحات الفيروسية على الطبقة الخلوية الأحادية، باستخدام مجهر تباين الأطوار. التقط صورًا حسب الحاجة بتكبير 40x و 200x.

اجمع السوائل الطافية من المزارع الخلوية عند النقطة الزمنية 96 ساعة، وقم بطرد السائل الطافي مركزياً بسرعة 300 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لإزالة الحطام الخلوي. بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة السوائل الطافية بعناية دون تحريك الحطام المترسب، وانقلها إلى أنابيب سعة 15 مليلتر.

قم بتخزين السوائل الطافية للمستنبتات الفيروسية في عدة حصص موزعة عند درجة حرارة 80- درجة مئوية.

لتقدير عيار الفيروس، ابدأ باستزراع خلايا Vero الساذجة في طبق يحتوي على 12 بئراً بمعدل 1×10⁵ خلية لكل بئر، في حجم 2 mL. وفي اليوم التالي، قم بتحضير تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف ل soprnatants المزرعة الفيروسية، التي تم جمعها من قارورة T160 باستخدام وسط خالٍ من المصل.

عند تحضير التخفيفات التسلسلية لسائل طافي من مستنبت فيروسي لتقدير العيار الفيروسي، تأكد من التعامل مع الفيروس بأمان لمنع العدوى.

بعد ذلك، قم بإزالة الوسط المستنفد من كل بئر في الطبق ذو الـ 12 بئراً الذي يحتوي على خلايا Vero، وأضف 400 µL من اللقاح المخفف فوق خلايا Vero في ثلاث مكررات. حضّن الأطباق الملقحة في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة تتراوح من أربع إلى ست ساعات.

في نهاية فترة الحضن، استبدل اللقاح بملليلترين من الوسط المكمل بالمصل في كل بئر. وبعد 48 ساعة من التلقيح، قم بعدّ البؤر الفيروسية عند التخفيفات المناسبة باستخدام مجهر تباين الأطوار. ثم احسب العيار الفيروسي بوحدات تشكيل اللويحات لكل ملليلتر.

بعد تلقيح خلايا Vero في طبق ذي 12 بئراً بعيارات عالية ومنخفضة من فيروس Zika، وتحضينها لمدة 48 و96 ساعة، يتم تقييم تضاعف الجينوم بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (quantitative PCR) للكشف عن تعبير جينوم فيروس Zika، وعن طريق الكيمياء النسيجية المناعية للخلايا للكشف عن الـ RNA مزدوج السلسلة.

لإجراء الكيمياء النسيجية المناعية للخلايا، قم بإزالة الوسط من آبار الطبق ذو الـ 12 بئراً، وأضف 1 ml من الميثانول إلى كل بئر. اترك الخلايا لتثبت عند درجة حرارة 4 °C لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، اغسل الخلايا المثبتة ثلاث مرات باستخدام 1x PBS. ثم أضف محلول الحجز (blocking buffer) وحضن الخلايا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. قم بتخفيف الجسم المضاد أحادي النسيلة للفئران المضاد للـ RNA مزدوج الشريط J2 بنسبة 1:100 في محلول الحجز، وأضفه إلى الخلايا، ثم حضن الخلايا في هذا المحلول طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. في اليوم التالي، خفف الجسم المضاد الثانوي من الماعز المضاد لـ IgG-594 الخاص بالفئران بنسبة 1:1,000 في محلول الحجز، وبعد غسل الخلايا باستخدام 1x PBS، أضفه إلى الخلايا وحضنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل الخلايا بـ 1x PBS، قم بصبغ النوى باستخدام صبغة Hoechst، وافحص الخلايا باستخدام مجهر فلوري بقوة تكبير 100x.

بعد مرور ست ساعات من استزراع خلايا Vero الساذجة في طبق ذي 12 بئراً، كما سبق، أضف السيتوكينات المطلوبة بالتركيزات المحددة في مكررات بيولوجية. وبعد 12 ساعة من المعالجة، قم بإجراء العدوى بفيروس Zika، مع تضمين آبار كضوابط سلبية بدون عدوى. وبعد أربع ساعات من العدوى، استبدل اللقاح الفيروسي بوسط مستزرع معالج بالسيتوكينات، ثم حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 44 ساعة إضافية. وعند مرور 48 ساعة بعد العدوى، قم بعدها اللويحات الفيروسية باستخدام مجهر تباين الطور، والتقط صوراً تمثيلية للخلايا المصابة بقوة تكبير 40x.

يوضح هذا الرسم البياني المحتوى الجينومي لفيروس Zika المقاس بواسطة RT-qPCR. أظهرت بادئات النمط الجيني الشامل (Pan genotype) وسلالة PRVABC-59 حساسية ونوعية متساويتين. وكما كان متوقعاً، لم تقم بادئات فيروس التهاب الكبد C بتضخيم أي ناتج.

تظهر هنا حركية نمو فيروس Zika عند النقاط الزمنية المحددة في الخلايا المصابة بعيارات منخفضة وعالية، مقارنة بالخلايا غير المصابة (المجموعة الضابطة المحاكية). وتُبين نتائج مقايسة الكيمياء النسيجية المناعية للخلايا أنه بعد 48 ساعة من الإصابة، تكون الخلايا المصابة في مجموعات قليلة، بينما تكون معظم الخلايا مصابة بعد 96 ساعة من الإصابة. ويظهر هذا الرسم البياني تعديل نمو فيروس Zika بواسطة سيتوكينات مختلفة، مقارنة بالمجموعة الضابطة التي تلقت المذيب الناقل.

تظهر صور تباين المرحلة هذه خلايا مصابة بفيروس Zika مع أو بدون علاج بالسيتوكين. ويمكن رؤية اللويحات الفيروسية التي شكلتها الخلايا المصابة على شكل بؤر. لاحظ أن الآبار المعالجة بالإنترفيرون لا تحتوي على لويحات فيروسية.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل رسم خرائط النطاقات عالية الدقة لفيروس Zika لتحديد مواقع البروتين الفيروسي وتضاعفه في خلايا البعوض والبشر للإجابة على أسئلة إضافية، مثل توضيح آلية إمراض المرض وتطور الضراوة الفيروسية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية إنشاء نظام استزراع معدٍ لفيروس Zika مختبرياً يعتمد على الخلايا الثديية لدراسة تضاعف فيروس Zika، بالإضافة إلى كيفية الاستفادة من هذه المنصة المختبرية في تطوير الأدوية واللقاحات.