عالية الدقة ورسم الخرائط البصرية الماوس العقدة الأذينية

الهدف العام من هذا البروتوكول التجريبي هو إجراء التخطيط الضوئي للعقدة الجيبية الأذينية في الفأر من قلب سليم يتم ترويته بطريقة لانجندورف (Langendorff) أو من تحضير أذيني معزول. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال الفيزيولوجيا الكهربائية والفيزيولوجيا المرضية للعقدة الجيبية الأذينية حول آليات اضطرابات ناظم الخطى، ومتلازمة الجيوب الأذينية المريضة، ومختلف أنواع اضطرابات نظم الأذين المرتبطة بالأمراض. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتيح استقصاء بارامترات متعددة في الأنسجة السليمة بدقة مكانية وزمنية عالية جداً.

بعد التأكد من مستوى التخدير المناسب عن طريق قرص إصبع القدم، استخدم مقص مايو (Mayo) منحني بطول 5.5 بوصة وملقط كيلي (Kelly) المرقئ بطول 5.5 بوصة لإجراء شق بطول واحد سنتيمتر في مقدمة الصدر. وباستخدام ملقط إيريس (Iris) منحني بطول أربع بوصات، أمسك أنسجة الرئة بسرعة واستخدم مقص إيريس بطول أربعة أثلاث بوصة لاستئصال الرئة والغدة الزعترية والقلب معاً، بالإضافة إلى التأمور. اغسل الأنسجة في محلول تيرود (Tyrode) المعدل المؤكسج عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.

بعد ذلك، استخدم مقصات Vannas Tubingen منحنية بطول 3 بوصات وملقط رقم 5 بطول 4/3 بوصة لإزالة الرئة والغدة الزعترية والأنسجة الدهنية من القلب. بعد ذلك، استخدم كانيولا مخصصة بقياس 21 gauge وملقطين B رقم 5 منحنيين بطول 4.3 بوصة لتركيب الكانيولا في الأبهر، مع إجراء تروية وتروية سطحية متزامنة للقلب باستخدام محلول Tyrode بدرجة حرارة 37 درجة مئوية، مع تمرير المحلول عبر مرشح نايلون مدمج بمسامية 11 micron قبل عملية التروية لمنع انسداد الدورة الدموية التاجية. ثم قم بتوصيل محول ضغط بـ Luer lock الموجود على خط التروية عبر صمام إيقاف ثلاثي لمراقبة الضغط الأبهري، مع ضبط سرعة التروية للحفاظ على الضغط الأبهري بين 60 إلى 80 millimeters of mercury حسب الضرورة.

لإجراء التخطيط البصري للعقدة الجيبية الأذينية من قلب تم ترويته بطريقة لانجندورف (Langendorff)، ضع العضو في وضع أفقي بحيث يكون الجانب الخلفي متجهًا للأعلى في حوض زجاجي للأعضاء النسيجية، واستخدم دبابيس بقطر 0.1 مليمتر لتثبيت قمة البطين في القاع المطلي بالسيليكون للحوض لمنع الحركة الناتجة عن تدفق السوائل أثناء التجربة. أدخل أنبوب سيليكون صغيرًا في البطين الأيسر عبر الوريد الرئوي، والأذين الأيسر، والصمام المترالي، واستخدم خيط حريري 40 لتثبيت الأنبوب في النسيج الضام المحيط. بعد ذلك، استخدم خيطًا حريريًا آخر 40 لربط الوريدين الأجوفين العلوي والسفلي، وثبّت حافة الزائدة الأذينية اليمنى بدبابيس في قاع الحوض.

قم بمد الطرف الآخر من الخيط الجراحي وتثبيته بدبوس في قاع الغرفة، ثم ضع قطب تحفيز مخصصاً على حافة الزائدة الأذينية اليمنى. بعد ذلك، ضع قطبين أحاديي القطب من إبر تخطيط كهربائية القلب بحجم 12 مليمتر بالقرب من قاعدة البطينين الأيمن والأيسر، وضع قطب التأريض الخاص بتخطيط كهربائية القلب بالقرب من قمة البطين. ولصبغ الأنسجة، احقن الصبغة المخففة في منفذ تروية مدمج بخط التروية التاجية ليتم توصيلها على مدار فترة تتراوح من خمس إلى سبع دقائق.

بعد 20 دقيقة من الاستقرار، أضف 0.5 milliliters من blebbistatin بدرجة حرارة 37 degree Celsius إلى سائل التروية، يلي ذلك حقن 0.1 milliliters من blebbistatin المخفف في 1 milliliter من محلول Tyrode بدرجة حرارة 37 degree Celsius في خط التروية التاجية على مدار خمس إلى سبع دقائق أخرى باستخدام منفذ حقن Luer lock مدمج. يجب استخدام blebbistatin بحذر؛ ولمنع ترسب المثبط، قم أولاً بإذابة blebbistatin في وسط تم تدفئته بوضوح إلى 37 degrees مع تحريك الخليط بقوة.

لرسم خريطة بصرية للعينة، قم أولاً بتثبيت شريحة زجاجية صغيرة مغطاة على سطح المحلول فوق النسيج لتقليل أي آثار حركية ناتجة عن اهتزاز المحلول. ثم باستخدام دليل ضوئي مرن ومتشعب مع ضوء استثارة يتم توفيره بواسطة مصباح هالوجين منخفض الضوضاء وتيار ثابت، وجه حزمة الضوء المُرشحة نحو النسيج وصور الإشارة الفلورية الناتجة. بعد تقويس القلب كما تم توضيحه للتو، قم بتشريح البطينين بعيداً عن الجانب الأمامي وافتح الأذين الأيمن عبر الصمام ثلاثي الشرفات على طول محور الوريد الأجوف العلوي للصمام ثلاثي الشرفات، يليه شق عبر الطرف الإنسي للعُرف النهائي (crista terminalis).

لفتح الجدار الحر للأذين الأمامي، يتم إجراء شق من الخط المتوسط لشق الطرف الإنسي وصولاً إلى حافة الزاوية السفلية اليمنى للزائدة الأذينية اليمنى، ثم يتم تثبيت الجدار الحر للأذين المسطح في قاع غرفة مطلية بالسيليكون. ولفتح الزائدة الأذينية اليسرى، يتم القطع عبر الصمام المترالي على طول الزاوية العلوية للصمام المترالي للزائدة الأذينية اليسرى. بعد ذلك، يتم تثبيت الأذين الأيسر المفتوح كما تم القيام به سابقاً بالنسبة للأذين الأيمن.

بعد ذلك، قم بإزالة أنسجة البطين جزئياً. حافظ على حافة من أنسجة البطين لتثبيت العينة بالدبابيس لمنع تلف الأذينين، ثم ثبت الأنسجة في قاع غرفة مطلية بمادة Sylgard. الآن، ارفع العينة النهائية بمقدار 0.5 millimeters تقريباً من قاع الغرفة المطلية بالسيليكون للسماح بالتروية السطحية من السطحين النخابي والشغافي، ثم قم بتروية العينة بمحلول Tyrode بدرجة حرارة 37 degree Celsius.

ثم ضع قطب تحفيز من كلوريد الفضة مُصنع خصيصاً على حافة ملحق الأذين الأيمن المُشرح. ضع قطباً أحادياً من إبر تخطيط كهربائية القلب مقاس 12 مليمتر بالقرب من كل من ملحقي الأذينين الأيمن والأيسر، وضع قطب التأريض الخاص بتخطيط كهربائية القلب بالقرب من الوصلة الأذينية البطينية. ولصبغ أنسجة القلب، استخدم ماصة سعة 1 مليمتر لإطلاق صبغة حساسة للجهد الكهربائي مُخففة في محلول Tyrode عند درجة حرارة 37 درجة مئوية ببطء مباشرة على الأنسجة.

ثم قم بتثبيت العينة من خلال التطبيق المباشر لـ blebbistatin المخفف على النسيج، يليه إعطاء 0.5 milliliters أخرى من blebbistatin عبر سائل التروية، ثم قم بإجراء الخرائط الضوئية للعينة كما تم توضيحه للتو. تُعد خطوات صبغ النسيج وتثبيط blebbistatin خطوات حرجة تتطلب تنفيذاً دقيقاً وإجراء صبغ دقيق لضمان عدم التأثير على المعاملات الفسيولوجية للأذين، بما في ذلك معدل ضربات القلب، وتوزيع منظم ضربات القلب الرائد، والتوصيل الأذيني. تظهر هنا خريطة كنتورية نموذجية لتنشيط الأذين الأيمن تمت إعادة بنائها لنظم جيبي تلقائي لقلب فأر خاضع لتروية Langendorff، مع خريطتين كنتوريتين متناظرتين للأذين الأيمن تم الحصول عليهما بمعدلات أخذ عينات تبلغ 1 و 0.5 millisecond.

تقع نقطة التنشيط المبكر ضمن المنطقة بين الوريدين بالقرب من الوريد الأجوف العلوي حيث يتم تحديد العقدة الجيبية الأذينية تشريحيًا. في هذه التجربة، وبعد تحفيز ملحق الأذين الأيمن لمدة دقيقة واحدة على الأقل بتردد يتراوح من 10 إلى 12 Hertz، تم إيقاف التحفيز الكهربائي وحساب وقت تعافي العقدة الجيبية الأذينية كفاصل زمني بين آخر جهد فعل تم التقاطه وأول جهد فعل تلقائي. ويسمح تنشيط تحضير الأذين المعزول أثناء النظم الجيبي التلقائي بتحديد المنطقة الدقيقة لموقع منظم ضربات القلب الرائد.

إذا تم اتباع إجراءات الجراحة وتحميل الصبغة بشكل صحيح، فلا ينبغي ملاحظة أي تغييرات جوهرية في الخصائص الفسيولوجية للأذين. وبالرغم من أن الصبغ الشرياني قد يتطلب كمية أكبر من الصبغة، إلا أن الإشارة الفلورية في أنسجة منطقة العقدة الجيبية الأذينية تبدو أكثر استقراراً باستخدام طريقة التحميل هذه، حيث يكون زمن اضمحلال شدة الإشارة بعد الصبغ التاجي أطول بمرتين تقريباً مقارنة بالصبغ السطحي. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون 30 إلى 40 دقيقة إذا نُفذت بشكل صحيح.

عند محاولة تطبيق هذا الإجراء، يجب الحرص على تحديد التشريح الأذيني قبل إجراء أي قطع لتجنب إتلاف أنسجة الأذين والعقدة الجيبية. وعقب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ تدابير أخرى مثل تسجيلات قطب الصمام المترالي الزجاجي التقليدية للإجابة على أسئلة إضافية حول خصائص جهد الغشاء التبادلي. وقد مهدت هذه التقنية بعد تطويرها الطريق للباحثين في مجال الفسيولوجيا العصبية لاستكشاف عدم انتظام ضربات القلب الأذينية، بما في ذلك خلل وظيفة العقدة الجيبية الأذينية في القلب.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء التخطيط البصري عالي الدقة لتحضير العقدة الجيبية للفأر.