ثلاثي الأبعاد فائقة الدقة المجهر من الشعيرات F-أكتين من التداخل PhotoActivated التعريب المجهري (iPALM)

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور الهيكل الخلوي للأكتين في خلايا الثدييات الملتصقة على مستوى البنية التحتية ، باستخدام طريقة الفحص المجهري ثلاثي الأبعاد فائقة الدقة تسمى iPALM. يوفر تصوير iPALM دقة مكانية نانومترية فرعية في جميع الأبعاد الثلاثة. يتيح ذلك تصور البنية الفوقية باستخدام مجسات الإزهار ، مما يسمح بخصوصية عالية لوضع العلامات.

يجب أن يكون الإجراء المقدم في هذا الفيديو قابلا للتكيف بسرعة ومفيدا لتصور ميزات البنية التحتية الأخرى في الخلايا عن طريق توطين جزيء واحد يعتمد على الفحص المجهري فائق الدقة. ابدأ هذا الإجراء عن طريق تحضير الخلايا على غطاء النظارات في طبق من ستة آبار. لتجميع عينة التصوير ، استخدم ملقطا دقيقا لإزالة زجاج غطاء العينة برفق من البئر العازلة.

ثم اضغط بسرعة وبلطف على المخزن المؤقت الزائد عن طريق لمس حافة زجاج الغطاء بورق مطوي وماص. ضع جانب خلية الغطاء الزجاجي متجها لأعلى على قطعة من ورق العدسة النظيف. اشطف العينة عن طريق وضع 30 إلى 50 ميكرولترا من مخزن التصوير المؤقت على العينة.

قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد عن طريق إمالة ورق ماص مطوي والنقر عليه. بعد تكرار خطوة الشطف عدة مرات ، ضع 30 إلى 50 ميكرولترا من مخزن التصوير المؤقت على العينة. جفف حافة زجاج الغطاء وضع عدة نقاط صغيرة جدا من الإيبوكسي سريع المعالجة على المنطقة المجففة.

قم بخفض زجاج غطاء آخر رقم 1.5 تم تنظيفه مسبقا ببطء على وسط الخلية التي تحتوي على زجاج غطاء 22 ملم. دع المخزن المؤقت للتصوير يبلل كلا الزجاجين المغطيين عن طريق العمل الشعري. يجب أن تلتصق النقاط الصغيرة من الإيبوكسي سريع المعالجة بكلا زجاجي الغطاء.

اضغط برفق على العينة المجمعة باستخدام ورق ماص مطوي لتوزيع الضغط بالتساوي. استخدم ضغطا كافيا لجعل خلية العينة رقيقة ومتساوية ، ولكن ليس بسحق الخلايا. قم بقياس السماكة المناسبة من خلال مراقبة نمط حلقات نيوتن.

تأكد من تنفيذ هذه الخطوة برفق لتقليل فقاعات الهواء. إذا لزم الأمر ، تدرب على أكواب الغطاء الفارغة عدة مرات مسبقا. بعد ذلك ، أغلق العينة بالبارافين اللانولين الفازلين المذاب.

ثم اشطف العينة المختومة بالماء منزوع الأيونات. جفف العينة بالهواء المضغوط لتحضيرها للتركيب على المجهر. حرك العدسة ذات الهدف العلوي المحملة بنابض لأعلى للسماح بإزالة حامل العينة.

ضع العينة المختومة على حامل العينة وثبتها بعدة مغناطيسات أرضية نادرة صغيرة. ضع زيت الغمر على جانبي عينة التصوير. ضع حامل العينة مرة أخرى في المسار البصري وقم بخفض العدسة الموضوعية العلوية برفق.

قم بتشغيل ليزر الإثارة. قم أيضا بتشغيل كاميرات EMCCD في وضع نقل الإطار. بعد ذلك ، قم بتدوير مرشحات الانبعاث المناسبة.

قم بتنشيط الغالق الميكانيكي لسد مسار الشعاع العلوي وفتح مسار الشعاع السفلي. قم بتركيز عدسة الموضوع السفلية عن طريق الترجمة بزيادات صغيرة باستخدام مشغل بيزو. بمجرد أن يصبح الإيماني في بؤرة بؤرة ، افتح مسار الشعاع العلوي مع سد مسار الشعاع السفلي وقم بتركيز عدسة الهدف العلوي بطريقة مماثلة.

راقب عرض الإيمانية على شاشة الكمبيوتر للحصول على التركيز الأمثل. للحصول على تركيز مناسب ، افتح كلا من مسارات الشعاع العلوي والسفلي. اضبط عدسة الهدف العلوي يدويا بينما يتم تثبيت الهدف السفلي باستخدام زوج من براغي الضبط الدقيقة حتى تتداخل الصور الائتمانية قدر الإمكان ، من الناحية المثالية في بكسل واحد.

بعد ذلك ، قم بإجراء تعديلات دقيقة بحيث تتداخل الصور الائتمانية في حدود عشر بكسل EMCCD. اضبط المرايا العلوية المثبتة على بيزو عبر برنامج التحكم مع تثبيت كل من العدسات الموضوعية ومرايا الانعكاس السفلية ثابتة. قارن بين مراكز الحسابات لطرق العرض الموضوعية العلوية والسفلية عبر شاشة الكمبيوتر لتوجيه العملية.

مع تشغيل الليزر ، تقوم الكاميرات بالتدفق المستمر ، وفتح كل من مسارات الشعاع العلوي والسفلي ، بتذبذب حامل العينة Z piezo باستخدام شكل موجة الجهد الجيبي الذي تم إنشاؤه بواسطة برنامج التحكم لتذبذب مستمر للمحور Z على حجم 400 نانومتر. قم بترجمة مجموعة مقسم الشعاع الآلي يدويا لأعلى أو لأسفل حتى تتأرجح شدة الشعاع الإيماني نظرا لتأثير تداخل الفوتون الفردي المطلوب ، فإن هذا يدل على المطابقة الوثيقة لأطوال المسار البصري.

يمكن تحقيق نسبة الذروة إلى الوادي التي تزيد عن 10 في الحالات المثلى. للتأكد من أن كل من السعة والطور في كل سطح متجانسان قدر الإمكان عبر المجال، اضبط المرآة السفلية لمجموعة مقسم الحزمة في خطوات صغيرة لضبط الفجوة وزوايا الإمالة. قم بإجراء محاذاة دقيقة لفاصل الشعاع عن طريق ترجمة العينة في ثماني خطوات نانومتر Z على مدى 800 نانومتر.

راقب الكثافة الائتمانية بين الكاميرات من واحد إلى ثلاثة. اضبط ارتفاع المرآة السفلية وموضعها وإمالتها داخل مجموعة مقسم الشعاع بخطوات صغيرة بحيث يتم تكبير مرحلة التذبذب للكاميرا الأولى بالنسبة للكاميرا الثانية ، من الناحية المثالية عند 120 درجة. بمجرد اكتمال المحاذاة الأولية ، قم بترجمة العينة للبحث عن مجال رؤية مناسب يحتوي على كل من الخلايا إلى الصورة والعديد من الإمكانيات القريبة.

ضع حاوية حول النظام لمنع الضوء الشارد والاضطرابات المحيطة. بمجرد العثور على منطقة التصوير ، قم بترجمة العينة مرة أخرى وسجل منحنى المعايرة لاستخدامه في عمليات استخراج إحداثيات Z اللاحقة. باستخدام الأمر acquire calibration scans مقابل موضع بيزو عينة في الواجهة الرئيسية.

بمجرد العثور على المنطقة المطلوبة والحصول على منحنى المعايرة ، أدخل أسماء الملفات المناسبة في البرنامج. افتح كلا من مسارات الشعاع العلوي والسفلي ، ثم قم بزيادة قوة الإثارة لليزر 642 نانومتر إلى أقصى حد. بالنسبة إلى Alexa Fluor 647 ، قد تكون هناك حاجة إلى فترة أولية لإيقاف تشغيل Fluor-4.

قم بتعريض الإثارة الثابتة 642 نانومتر لمدة خمس دقائق ، أو أكثر إذا لزم الأمر ، حتى يتم ملاحظة وميض جزيء واحد. يسمح البرنامج بزيادة تلقائية قدرها 405 نانومتر من التنشيط الضوئي أثناء عملية الاستحواذ. عادة ما تكون هناك حاجة إلى أعداد كبيرة من إطارات الاستحواذ حتى تكون الميزات الخيطية مرئية بوضوح.

عندما تكون جاهزا ، ابدأ في الحصول على مجموعات الصور الأولية باستخدام الأمر start iPALM acquisition في الواجهة الرئيسية. أثناء الاستحواذ ، قم بضبط مستوى تنشيط الصورة عن طريق ضبط شدة الليزر 405 نانومتر للحفاظ على كثافة الوميض المناسبة حسب الحاجة. عندما يتم تجميع زلة غطاء العينة بشكل صحيح ، يمكن ملاحظة حلقات نيوتن بالعين المجردة تحت الإضاءة المحيطة أو إضاءة الفلورسنت القياسية.

يتطلب استخراج المواضع المحورية لبواعث التألق تداخلا متزامنا متعدد الأطوار في تصوير iPALM ، والذي تتم معايرته بواسطة تغيرات شدة إمانة معينة في ثلاثة EMCCDs. ثم يتم تطبيع الشدة وملاءمتها لتحديد اختلافات الطور. فيما يلي صورة إعادة الإعمار iPALM مع كل إحداثيات توطين مقدمة بواسطة Gaussian ثنائي الأبعاد بعرض يتوافق مع عدم اليقين في التوطين.

يتم تلوين إحداثيات Z وفقا لشريط الألوان. يمكن رؤية مناطق ذات السمات الخيطية الكثيفة والمتناثرة. تظهر هنا صور إعادة بناء iPALM للهيكل الخلوي للأكتين لخلايا HUVEC المسماة بواسطة Alexa Fluor 647 phalloidin.

لون الصورة إلى إحداثيات Z وفقا لشريط الألوان. يتم إنشاء الرسم البياني للمقطع العرضي المستعرض من إحداثيات التوطين XY على طول المحور الطويل للمنطقة المعبأة. يظهر التركيب الغوسي عرضا كاملا بنصف حد أقصى 43.88 نانومتر مرتبط بالمقطع العرضي.

هذا الرسم البياني هو من الموضع Z لإحداثيات التوطين في المنطقة المعبأة. يظهر التركيب الغوسي عرضا كاملا بنصف 17.50 نانومتر كحد أقصى. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في 90 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم لكيفية تصور الهيكل الخلوي للأكتين في البنية التحتية باستخدام iPALM من خلال التحضير والتركيب البسيط ، والمحاذاة البصرية ، والحصول على البيانات الأولية ، والتحليل اللاحق لإعادة بناء الصور فائقة الدقة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للأبحاث في مجال بيولوجيا الخلية لاستكشاف البنية النانوية للهيكل الخلوي للأكتين ، بالإضافة إلى هياكل التصاق الخلية مثل الالتصاقات البؤرية.