تدفق تحليل Cytometric من القاتل الطبيعي خلية التحللي آخر في الدم الجامع البشري

الهدف العام من هذه التجربة هو تحديد عدد الخلايا القاتلة الطبيعية ومستويات التنشيط السامة للخلايا في عينة دم بشرية كاملة بطريقة سريعة وموثوقة ومستقرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة في المجالات المناعية ، مثل ، ما هي آثار التدخلات الخارجية على النشاط الحيوي للخلايا القاتلة الطبيعية؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سريعة ودقيقة ، مع الاستمرار في تقديم نتائج قابلة للتكرار عبر التجارب.

لعزل الخلايا القاتلة الطبيعية من الدم البشري الكامل ، ضع أولا أنابيب 15 ملليلتر تحمل علامة عينة الدم الكامل والكسر السالب والكسر الموجب في المواضع المناسبة في رف أنبوب فاصل الخلية. عند تحميل جميع الأنابيب ، أدخل رف الفاصل على جهاز أخذ العينات الصغير لوضع العلامات التلقائي ، وحدد الكاشف في القائمة ، لتمييز الموضع الذي سيتم وضع القارورة فيه على الرف. حدد قراءة الكاشف لتنشيط قارئ التعليمات البرمجية ثنائية الأبعاد وحمل قارورة الكاشف المناسبة أمام قارئ التعليمات البرمجية ثنائية الأبعاد بزاوية 0.5 إلى 2.5 سم من غطاء قارئ التعليمات البرمجية.

ضع قارورة القراءة في موضع رف الفاصل المناسب. بعد ذلك ، ضمن علامة التبويب الفصل ، قم بتمييز المواضع المطلوبة. ثم افتح القائمة الفرعية التسمية وحدد برنامج التسمية التلقائية.

قم بتعيين ميكروبيدات كاشف فصل الخلية إلى مواضع الرف 1 و 2 و 3 و 4. وحدد برنامج Posselwb separaton. حدد برنامج شطف الغسيل.

أدخل 1500 ميكرولتر لحجم العينة ضمن القائمة الفرعية مستوى الصوت، واضغط على Enter. ثم انقر فوق تشغيل لبدء فصل الخلية. انقر فوق موافق للتأكد من توفر مخزن مؤقت كاف لمعالجة جميع العينات.

لتحضير عينة فحص السمية الخلوية ، قم أولا بتسمية أنابيب 1.5 ملليلتر لكل عينة و / أو مشارك حسب الاقتضاء ، وقم بإخراج النسبة المطلوبة من الخلايا القاتلة الطبيعية وخلايا K562 المسماة DIO في كل أنبوب. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وقم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج حبيبات الخلية. بعد ذلك ، أعد تعليق خليط الخلية في 500 ميكرولتر من وسط الخلية القاتلة الطبيعية غير المكتمل ، وقم بتسمية الخلايا الموجودة في كل أنبوب ب 5 ميكرولتر من يوديد البروبيديوم.

اجمع الخلايا عن طريق طرد مركزي آخر ، واحتضان ثقافة الإعدام عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. في نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي للخلايا في نفس ظروف الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في 25 ميكرولترا من وسط زراعة الخلايا القاتلة الطبيعية الطازجة غير المكتملة. لتحليل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي ، انقر أولا فوق زر بدء التشغيل في برنامج مقياس التدفق الخلوي للتصوير لتنظيف النظام.

بعد ذلك ، انقر فوق زر المخطط المبعثر لإنشاء أربع مخططات مبعثرة ، وقم بتحميل أنبوب التحكم الإيجابي المزدوج. باستخدام عينة التحكم الإيجابية المزدوجة ، حدد الكثافة المطلوبة لليزر 405 مللي واط ، بحيث لا يتم تحميل الكاشف بشكل زائد ، واضبط جهاز التصوير للحصول على العدد المناسب من عدد الخلايا. سيتطلب ضبط ليزر 405 مللي واط بكثافة مناسبة للكشف عن كل من DIO و PI خبرة في كل من الأصباغ ونطاق الكشف عن مقياس التدفق الخلوي.

بعد انتهاء الحصول على عينة التحكم الإيجابية المزدوجة ، قم بتحميل عينة التحكم في DIO فقط ، وحدد هدف 40X ، وقم بإيقاف تشغيل ليزر 642 مللي واط وقناة Brightfield. قم بتربية العدد المناسب من الخلايا وكرر عملية الاستحواذ على عينة يوديد البروبيديوم فقط. عند تشغيل جميع عينات التحكم، قم بتشغيل الليزر 405 مللي واط وقناة Brightfield، وأعد تشغيلها، وانقر فوق تعيين الكثافة.

بعد ذلك، ضمن علامة التبويب "الحصول على الملفات"، أدخل اسم ملف مخصصا، وحدد مجلدا لحفظ ملفات البيانات. بعد ذلك ، أدخل عدد الخلايا التي تريد الحصول عليها. قم بتحميل أنبوب العينة التجريبي الأول وانقر فوق الزر Acquire.

عند تشغيل جميع العينات، افتح تطبيق برنامج تحليل مقياس التدفق الخلوي للتصوير، وافتح ملف RIF تجريبي واحد. ضمن علامة تبويب التعويض، حدد إنشاء مصفوفة جديدة. سيطالب البرنامج باختيار ملفات اللون الفردي ، ودمجها لإنشاء ملف مصفوفة ليتم تحديده لتطبيق تعويض القناة.

استخدم الدالة Building Blocks لإعداد المخططات النقطية المناسبة. ثم انقر فوق وظيفة الإحصائيات للوصول إلى أرقام الخلايا في كل بوابة. في هذه التجربة التمثيلية ، تم سحب عينات الدم كما هو موضح وتم قياس تركيز الخلايا القاتلة الطبيعية لكل مليلتر من الدم الكامل لكل عداء ، وفي المتوسط لكل نقطة زمنية.

قدم ثلاثة من كل أربعة عدائين زيادة طفيفة مماثلة في عدد الخلايا القاتلة الطبيعية بعد التمرين. يليه مباشرة انخفاض حاد ، قبل العودة ببطء إلى طبيعته ، بعد 24 إلى 48 ساعة من نهاية الحدث. في المتوسط ، انخفض عدد الخلايا القاتلة الطبيعية بعد 1.5 ساعة من التمرين ، لكنه عاد إلى المستويات القريبة من المستويات الطبيعية بعد 24 ساعة.

بعد حساب عدد الخلايا ، تم تحليل النشاط السام للخلايا للخلايا القاتلة الطبيعية على الفور كما هو موضح للتو ، مع انخفاض متوسط في السمية الخلوية للخلايا القاتلة الطبيعية على الفور ، وبعد 1.5 ساعة من إنهاء حدث التمرين ، زاد ذلك بشكل ملحوظ بمقدار 24 ساعة بعد التمرين. ظلت السمية الخلوية NK مرتفعة مقارنة بمستويات ما قبل التمرين ، وإن كان ذلك بشكل غير ملحوظ. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في حوالي أربع ساعات عند إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على عدد الخلايا القاتلة الطبيعية والنشاط السام للخلايا من عينات الدم البشري ووصفها بطريقة مائية قابلة للتكرار.