استخدام 3D تكنولوجيا الطباعة لدمج التصوير بالرنين المغناطيسي مع الأنسجة: بروتوكول لالدماغ باجتزاء

الهدف العام من هذا البروتوكول هو محاذاة أحجام صور التصوير بالرنين المغناطيسي بدقة مع المقاطع النسيجية من خلال إنشاء حاملات دماغ وصناديق تقطيع مخصصة ومطبوعة ثلاثية الأبعاد. وبينما يركز هذا الفيديو على أنسجة دماغ مستخلصة من حيوان المرموزيت، يمكن تطبيق هذا البروتوكول على أي دماغ سواء كان قادمًا من قارض، أو رئيسي غير بشري، أو إنسان. قم بتجهيز محطة العمل كما هو موضح في البروتوكول.

املأ الأنبوب بـ Fomblin والشاش حتى علامة 20 milliliter. اضغط على الشاش لإزالة فقاعات الهواء أثناء العملية. جفف الدماغ بلطف من formalin.

بعد ذلك، أدخل الدماغ بحيث يكون الجزء الأمامي باتجاه قاع الأنبوب. قم بتثبيت الدماغ بعناية داخل الأنبوب باستخدام الشاش حول جانبي الدماغ لتثبيت موضعه. املأ بقية الأنبوب بالشاش وFomblin.

قم بإزالة الفقاعات الهوائية بعناية طوال العملية. ثم أحكم إغلاق الغطاء وقم بسد الأنبوب باستخدام البارافين. ضع علامة على الغطاء والخط الذي يوازي الشق بين نصفي الكرة المخية.

بعد ذلك، قم بلف الأنبوب بمنشفة ورقية وأدخله في الملف بحيث تكون العلامة في الموضع العلوي المركزي. أدخل الملف في ماسح MRI. بعد عملية الاستحواذ والمعالجة البعدية، نحصل على صورة مرجحة بـ T2 يمكننا استخدامها لإنشاء نموذج رقمي للدماغ.

افتح صورة الرنين المغناطيسي (MRI) في الاتجاه الإكليلي. ثم استخدم أدوات التحويل لإعادة أخذ عينات من الصورة إلى فوكسلات متساوية القياس بمقدار 1 millimeter. بعد ذلك، طبق مرشح خفض ضجيج غير خطي.

اختر جدول البحث (look up table) من قائمة العرض. ثم انقر فوق زر العتبة المزدوجة (dual Threshold). اسحب شريط التمرير الموجود على الرسم البياني ليغطي الدماغ بالكامل.

قم بإنشاء قناع ثنائي للدماغ باستخدام خوارزمية التجزئة Threshold using min/max. أدخل القيمة الموجودة في الركن السفلي الأيسر من رسم البيان الكثافي، أسفل المقياس مباشرةً، في مربع الحد الأدنى (Lower limit). ثم اختر Binary وقم بإلغاء تحديد Inverse threshold.

اختر خوارزمية Morphological، ثم Fill holes. قم بتفعيل خيار Process in 2.5D. لملء الفجوة بين الدماغ الخلفي والقشرة المخية، اختر line VOI.

قم برسم اتصال بين الدماغ الخلفي والقشرة المخية على كلا جانبي الدماغ عند النقطة الأكثر جانبيّة. استمر في رسم اتصالات مناطق الاهتمام (VOI) عبر الدماغ. ثم قم بتحويل مناطق الاهتمام (VOIs) إلى قناع ثنائي (Binary mask).

استخدم حاسبة الصور (Image calculator) لدمج أقنعة VOI و brain Binary عن طريق اختيار عملية OR. حدد خيار Promote destination image type. اختر الآن خوارزمية المورفولوجيا (Morphological algorithm)، Fill holes.

قم بتفعيل خيار Process in 2.5D. اختر الخوارزمية Extract surface ثم Select Mask image، وأدخل اسماً، وبعد ذلك اختر نوع الملف ply. يمكن وضع الفجوات في صندوق القطع المقابلة لموقع مستوى الشريحة بدءاً من مقدمة الدماغ، أو مؤخرة الدماغ، أو بالنسبة لمنطقة ذات أهمية مثل الآفات في المادة البيضاء الظاهرة هنا.

باستخدام أداة تحديد المنطقة ذات الاهتمام (box VOI)، ارسم مربعاً حول الدماغ. انسخ المربع والصقه على عدد شرائح التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) التي تتوافق مع سمك فجوات الصفائح المقصودة. ثم انتقل للأمام بمقدار عدد شرائح MRI لكل مقطع، وكرر وضع المربع كما فعلت سابقاً لإنشاء فجوة شفرة أخرى.

كرر هذه العملية في جميع أنحاء الدماغ. قم بتحويل مناطق الاهتمام (VOIs) الصندوقية إلى قناع ثنائي (Binary mask). ثم استخرج السطح باستخدام "Extract surface" كما تم القيام به سابقاً بالنسبة للدماغ.

حدد القناع الثنائي (Binary mask) الخاص بفجوة الشفرة. استخدم عملية "Image math" لضربه في 10,000. بعد ذلك، استخدم "Image calculator" لإضافة القناع الثنائي المضروب إلى صورة الرنين المغناطيسي (MRI) المتساوية الخصائص المعاد أخذ عينات منها.

الآن، ومن خلال اختيار العرض ثلاثي المستويات، يمكن رؤية خريطة شفرة الرنين المغناطيسي (MRI blade map) التي توضح موقع تقطيع الدماغ في ثلاثة مناظر متعامدة. في برنامج Netfabb Professional، اختر "Add part"، ثم حدد نموذج "Blade Gap" وطبقات "Brain Model".

اختر نموذج الدماغ وانقر على وضع الإصلاح. استخدم زر اختيار القشرة لتحديد الدماغ. ثم قم بتبديل الاختيار إلى القشور الأخرى واحذفها.

بعد ذلك، قم بتطبيق الإصلاح وإزالة الجزء القديم. مع تحديد الدماغ، اختر Move. انقر فوق to origin وسجل المعلمات في مربعات X و Y و Z.

هذه الأدوات ضرورية للحفاظ على وضعية الفجوة بين الشفرات. انقر على ترجمة. ثم أغلق النافذة.

اختر نموذج Blade Gap وقم بترجمته باستخدام المعلمات المسجلة من الخطوة السابقة. اختر نموذج الدماغ ثم انقر على وضع الإصلاح (repair mode). استخدم زر اختيار الغلاف (shell selection) لتحديد الدماغ.

ثم اختر Smooth triangles. وأدخل الرقم أربعة في خانة Iterations. وقم بتفعيل خيار Prevent volume shrinking.

حدد خيار Reduce Triangles وأدخل 200000 في مربع Target Triangle Count. ثم حدد Automatic repair وقم بإجراء إصلاح افتراضي. قم بتطبيق الإصلاح.

ثم قم بتصدير نموذج الدماغ المنعم بصيغة STL. استورد نموذج الدماغ المنعم في برنامج Meshmixer. استخدم أدوات النحت لتنعيم المناطق المحددة بواسطة خطوط مناطق الاهتمام (VOIs).

وقم بإصلاح أي عيوب طفيفة أخرى في النموذج. استورد نموذج الدماغ المُعدل والمُنعم إلى برنامج Netfabb Professional. ثم أضف الجزء، أجزاء مقطع الدماغ لقرد المرموسيت.

اختر "Shells" لتحويلها إلى أجزاء. بعد ذلك، قم بتغيير اسم كل جزء كما هو موضح في البروتوكول. وباستخدام إعدادات التحديد الموضحة في البروتوكول، انقر واسحب الأجزاء لوضع الدماغ في مركز الصندوق.

انقر واسحب الأجزاء لضبط عمق الدماغ في الصندوق. حدد نموذج الدماغ المنعم والمعدل، وفي صندوق نموذج القطع حدد العملية البولينية (boolean operation). انقر على نموذج الدماغ لتحويل لونه إلى الأحمر.

ثم اختر الطرح البولياني (boolean subtraction). قم بتطبيق الحسابات. تحقق من وجود أي بروزات قد تمنع وضع الدماغ بشكل صحيح.

راجع القسم التكميلي من البروتوكول لمعرفة طريقة إزالتها. حدد نموذج فجوة الشفرة وانقر على "نقل". قم بالتسجيل عند الموضع Z.

سيكون هذا موضع الفجوة الأكثر خلفية للشفرة. بعد ذلك، أغلق النافذة. اختر جزء الشفرة من أجزاء قطاعة الدماغ وانقر على تحريك.

أدخل قيمة Z من الخطوة السابقة. ثم أدخل قيم الموضع الحالي X و Y. اختر Translation مطلق (absolute Translation) ثم قم بالتحريك.

انقر فوق Duplicate. إذا كان سمك المقطع متسقاً، كما هو موضح هنا، فأدخل إجمالي عدد الشفرات (blade number) والعدد الإجمالي (total count) وعدد Z (Z count)، ثم أدخل سمك المقطع في مربع Z gap. بعد ذلك، اختر duplicate.

اختر جزء شفرة الميكروتوم من أجزاء قطاعة الدماغ. كرر نفس خطوات النقل والتكرار التي تم تنفيذها مع جزء الشفرة. حدد جميع شفرات الميكروتوم وحامل الشفرات الرئيسي ثم انقر فوق العملية المنطقية (boolean operation).

حدد جميع شفرات الميكروتوم (Microtome Blades) لتحويل لونها إلى الأحمر، ثم انقر على الطرح المنطقي (boolean subtraction). بعد ذلك، قم بتطبيق الحسابات. ادخل إلى وضع الإصلاح واختر الإصلاح التلقائي.

قم بإجراء إصلاح موسع (Extended Repair) ثم طبّق الإصلاح. قم بتصدير حامل الشفرات بصيغة STL. اختر جميع الشفرات، والصناديق الرئيسية والفرعية، ونموذج الدماغ المعدل والمنعم، ثم انقر فوق العملية البوليانية (boolean operation).

استخدم نافذة اختيار الأجزاء (Parts selection) لتحويل جميع الأجزاء إلى اللون الأحمر، باستثناء الصندوق الرئيسي. ثم اختر عملية الطرح المنطقي (boolean subtraction)، وقم بتطبيق الحسابات.

أدخل إلى وضع الإصلاح وحدد المربع الخاص بالحواف الحادة التي قد تسبب إصابة للدماغ. يمكن إصلاح هذه الحواف في وضع الإصلاح ببرنامج Netfabb، أو باستخدام أدوات النحت في برنامج Meshmixer.

ثم اختر الإصلاح التلقائي (Automatic repair). قم بإجراء إصلاح موسع (Extended Repair)، ثم طبق الإصلاح.

قم بتصدير صندوق الدماغ بصيغة STL. في برنامج Cura، اختر "Load" واستورد صندوق الدماغ، ثم انقر على زر "Rotate".

ثم انقر واسحب لجعل الصندوق مسطحاً. قم بتحرير إعدادات الطباعة كما هو موضح في البروتوكول. وبعد ذلك، احفظ مسار الأداة.

اتبع نفس العملية بالنسبة لحامل الشفرة وقم بتكرار الكائن أيضاً. ثم احفظ مسار الأداة. بعد وضع طبقة رقيقة من الغراء على منصة الطباعة، اطبع صندوق الدماغ وحوامل الشفرات باستخدام الطابعة ثلاثية الأبعاد وفقاً للإعدادات الموضحة في البروتوكول.

بعد اكتمال الطباعة، يمكن تحضير الدماغ للتقطيع. قم بتجهيز محطة العمل كما هو موضح في البروتوكول. ضع الدماغ بعناية في الصندوق وتأكد من تثبيته بإحكام في مكانه.

ضع شفرات الميكروتوم (Microtome Blades) الموجودة في حامل الشفرات في الفجوات المقابلة لها في الصندوق. مع ارتداء القفازات الواقية، اضغط على حوامل الشفرات بقوة. قم بتطبيق ضغط بطيء ومتوازن لتقطيع الدماغ.

قم بإزالة الشرائح واحدة تلو الأخرى بدءاً من الجزء الأمامي للدماغ. وعلى الرغم من أن هذا النهج مباشر، إلا أن الطريقة تتطلب العديد من الخطوات، بالإضافة إلى استخدام عدة أنواع من البرمجيات، لذا يجب على الباحثين التعرف على واجهات المستخدم قبل بدء الإجراء. يلخص سير العمل هذا البروتوكول الخاص بصناعة صندوق تقطيع دماغ القرد المرموسيت.

يتم تثبيت الدماغ باستخدام الفورمالين (Formalin)، ويتم الحصول على صور رنين مغناطيسي (MRI) مرجحة بالزمن T2 بدقة 150 ميكرون. تُعالج الصور وتُطبق عليها عتبة تحديد (thresholded) لإنشاء قناع ثنائي (Binary mask)، ثم يتم تمثيل السطح باستخدام برنامج للنمذجة ثلاثية الأبعاد.

تؤدي عملية طرح منطقي (boolean subtraction) بين قالب التقطيع ونموذج الدماغ إلى إنشاء النموذج الرقمي لقطاعة الدماغ. بعد ذلك، يتم طباعة صندوق قطاعة الدماغ باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد. ثم يوضع الدماغ بإحكام داخل صندوق القطاعة لبدء عملية التقطيع.

بمجرد تقطيع الدماغ، يكشف المقارنة البصرية بين صور الرنين المغناطيسي الحية (In Vivo) وصور الرنين المغناطيسي بعد الوفاة، وصور الأسطح السطحية للشرائح، عن تطابق جيد في التوجيه عبر شرائح متعددة. وتظهر مقارنة أكثر تفصيلاً بين الرنين المغناطيسي عالي الدقة بعد الوفاة والمقاطع النسيجية المصبوغة بـ LFB CV من شرائح دماغية متعددة تطابقاً دقيقاً ومتسقاً عبر جميع هياكل دماغ القرد المرموسيت. وفي هذا النموذج الحيواني للتصلب المتعدد، تطور الحيوانات آفات في المادة البيضاء منتشرة في جميع أنحاء الدماغ.

باستخدام هذه التقنية، يمكن تتبع الآفات الصغيرة التي تم اكتشافها عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي الحي (In Vivo MRI) في كل من التصوير بالرنين المغناطيسي بعد الوفاة ومقاطع علم الأنسجة. كما يمكن أن يكشف علم الأنسجة والتصوير بالرنين المغناطيسي بعد الوفاة عن آفات قد يتم إغفالها في التصوير بالرنين المغناطيسي الحي. وفي هذه الحالة، لم يظهر التصوير بالرنين المغناطيسي الحي دليلاً مقنعاً على وجود إشارة عالية الشدة طبيعية تشير إلى وجود آفات في أي من السبيلين البصريين.

ومع ذلك، لوحظت في تصوير الرنين المغناطيسي بعد الوفاة وجود فرط في كثافة الإشارة في السبيكة البصرية. وقد تطابقت هذه المناطق مباشرة مع الآفات المييلينية التي ظهرت في مقطع نسيجي مصبوغ بـ LFB CV. وبناءً على ذلك، تتيح المنهجية المقدمة هنا للباحثين تقييم الباثولوجيا الكامنة وراء نتائج تصوير الرنين المغناطيسي بدقة.

نعتقد أن هذا نهج واعد لتحديد مؤشرات حيوية جديدة للأمراض التي تصيب الدماغ ولعمليات مرضية محددة مثل الالتهاب وإعادة تكوين الميالين.