كشف الإنتاجية العالية للجهاز التنفسي مسببات الأمراض في العينات الحيوانية التي كتبها النانو PCR

الهدف العام من منهجية اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي هو اكتشاف كل من مسببات الأمراض القائمة على الحمض النووي والحمض النووي الريبي معا بطريقة عالية الإنتاجية. سيتم تضخيم الحمض النووي من العينات السريرية مسبقا باستخدام مجموعة أولية مشتركة يتم تحميلها على لوحة OpenArray وتحليلها بحثا عن وجود مسببات الأمراض. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تعزيز جهود مراقبة OneHealth للأمراض المعدية.

بالمقارنة مع التقنيات التقليدية ، تسمح هذه الطريقة باختبار المزيد من العينات لمزيد من الأهداف دون التنافس مع بعضها البعض ، وبالتالي تحسين كفاءة الاختبار. تستخدم الطريقة لوحة PCR نانوية مخصصة. تتم طباعة البادئات والمجسات على حواف الثقوب ويتم تحميل العينات باستخدام معالج سائل.

سنوضح الطريقة على العينات السريرية التي يتم اختبارها لمجموعة من مسببات الأمراض التنفسية للخيول. لبدء هذا الإجراء ، صمم اللوحة كما هو موضح في بروتوكول النص. تم تكوين اللوحة المستخدمة هنا ب 18 هدفا في ثلاث نسخ.

أضف الوسائط إلى المسحات وغسول القصبة الهوائية بحيث يكون هناك ما لا يقل عن واحد إلى ملليلترين من السائل. دوامة المسحة و DMEM بقوة في الأنبوب. بعد ذلك، استخدم ماصة لنقل ما يقرب من 1 ملليلتر من الوسائط إلى أنبوب جديد.

أضف 235 لترا صغيرا من محلول التحلل و 175 لترا صغيرا من العينة إلى كل أنبوب خرزة. تابع بروتوكول الشركة المصنعة لاستخراج الحمض النووي الكلي. استعد للنسخ العكسي والتضخيم المسبق للحمض النووي أو مكبر الصوت كما هو موضح في بروتوكول النص عن طريق التحقق أولا من خريطة العينة.

أضف 8.5 لتر ميكرو من مزيج مكبر الصوت الرئيسي و 5.5 ميكرو لترات من عينة الحمض النووي / الحمض النووي الريبي إلى كل بئر من لوحة قياسية مكونة من 96 بئرا باستخدام الجانب الأيسر من اللوحة فقط. بعد الجمع بين العينات وعناصر التحكم الإيجابية وعناصر التحكم السلبية مع مزيج مكبر الصوت ، قم بإغلاق اللوحة القياسية المكونة من 96 بئرا تماما بختم لاصق شفاف. قم بإزالة أي مانع تسرب زائد باستخدام شفرة حلاقة لمنع تكوين فجوات مانعة للتسرب أثناء ركوب الدراجات.

بالطرد المركزي للوحة المختومة لمدة 20 ثانية باستخدام جهاز تدوير لوحة PCR. تحقق للتأكد من دمج جميع الكواشف في قاع آبار الألواح. بعد تشغيل جهاز التدوير الحراري التقليدي ، حدد برنامج ركوب الدراجات المضخم وابدأ البرنامج.

ضع اللوحة المكونة من 96 بئرا في جهاز التدوير الحراري فقط عندما يصل الجزء السفلي من جهاز التدوير الحراري إلى درجة الحرارة المطلوبة لإنتاج (كدنا) من خلال مراقبة قراءة درجة الحرارة على الشاشة. بمجرد اكتمال تشغيل مكبر الصوت ، تحقق من أن اللوحة ظلت محكمة الإغلاق. بعد ارتداء قفازات مزدوجة وأغطية الأكمام ، قم بإزالة الختم من لوحة مكبر الصوت.

ثم قم بإزالة القفازات الخارجية والتخلص منها بعناية. قم بتخفيف منتجات مكبر الصوت من واحد إلى خمسة عن طريق إضافة 56 لترا صغيرا من المخزن المؤقت TE إلى كل بئر من الأعمدة من واحد إلى ستة من لوحة مكبر الصوت المكونة من 96 بئرا والخلط عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. للقيام بذلك ، انتقل فقط إلى المحطة الأولى للماصة ، واستنشق من الأسفل واستغني عنه أعلى ولكن لا تصنع فقاعات.

أضف المخزن المؤقت TE إلى جميع الأعمدة الستة بغض النظر عن الآبار غير المستخدمة. استعد لنقل 384 بئر إلى لوحة التضخيم كما هو موضح في بروتوكول النص. عند الانتهاء من خطوات التحضير ، ارتد قفازات مزدوجة وأغطية أكمام جديدة مجهزة جيدا.

نظرا لمعدلات التبخر العالية أثناء سحب العينات بكميات منخفضة، من الأهمية بمكان توزيع المزيج الرئيسي وأخذ العينات بكفاءة وإغلاق اللوحة على الفور. أضف 2.5 لتر ميكرو من مزيج التضخيم الرئيسي إلى لوح 384 بئر. تستخدم الألواح البيضاء هنا لأغراض العرض التوضيحي ولكن يجب استخدام الألواح السوداء لتقليل إجهاد العين.

انقل 2.5 لتر ميكرو من منتج مكبر الصوت المخفف إلى لوحة 384 بئرا وفقا للخريطة الموجودة في بروتوكول النص. يوضح النرد الملون الموضح هنا تسلسل النقل لماصة القناة الثابتة. قم بتغطية اللوحة على الفور بإحكام بختم رقائق معدنية.

تخلص من القفازات الخارجية وأغطية الأكمام. جهاز الطرد المركزي للوحة 384 بئر لمدة 20 ثانية في الدوار لوحة PCR. لا تقم بإزالة ختم الرقائق ، ولكن ضع اللوحة المكونة من 384 بئر في معالج السائل.

افتح العبوة التي تحتوي على لوحة تضخيم مغلفة وضعها بعناية في معالج السائل في الفتحة الأولى مع الرقم التسلسلي على اليمين ، وأمسك العلبة من الحواف دون لمس سطح اللوحة. قم بإزالة ختم القصدير من اللوحة التي تحتوي على 384 بئر داخل معالج السوائل بمجرد وضع كل شيء في مكانه. انقر فوق التالي ثم حدد جميع المربعات عند اكتمال كل خطوة.

أغلق باب معالج السوائل وابدأ عملية التعبئة على الفور. ابق بجوار معالج السوائل وانتقل على الفور إلى الخطوة التالية بمجرد ملء اللوحة. أثناء تشغيل معالج السائل ، قم بإزالة الطبقة الواقية من أسفل غطاء العلبة.

اترك الفيلم العلوي في مكانه. قم بتجهيز الشريط الأحمر عن طريق سحبه قليلا لتحريره من المادة اللاصقة. قم بإزالة لوحة التضخيم المحملة من معالج السوائل وضعها برفق في مكبس اللوحة مع الرقم التسلسلي على اليمين.

ضع الغطاء أعلى اللوحة مع الطرف المحزز على اليمين والمادة اللاصقة في الأسفل. اسحب ذراع ضغط اللوحة لأسفل وأغلقه بعناية ، وسوف يومض الضوء لمدة 20 ثانية. لا تلمس مكبس اللوحة خلال هذا الوقت.

بمجرد أن يتحول الضوء إلى اللون الأخضر الثابت ، ارفع الرافعة وقم بإزالة اللوحة المختومة بعناية عن طريق تثبيتها على الحواف. أثناء إمساك لوحة التضخيم محكمة الغلق عموديا من حواف العلبة، أدخل طرف المحقنة على الفور في منفذ التحميل في نهاية العلبة، ثم قم بتوزيع سائل الغمر ببطء بحركة واحدة متواصلة لطيفة لملء الفراغ بين اللوحة والغطاء. اترك فقاعة هواء صغيرة في الزاوية بمجرد غمر اللوحة.

مع الاستمرار في تثبيت اللوحة عموديا من الحواف ، أغلق منفذ التحميل عن طريق إدخال القابس في المنفذ ولف القابس في اتجاه عقارب الساعة ، واضغط بضغط كاف حتى ينكسر المقبض. نظف العلبة بمنديل خال من النسالة تم رشه جيدا بالإيثانول. لتجفيف العلبة ، امسح العلبة لأسفل بمنديل نظيف.

أحضر اللوحة المختومة إلى آلة التضخيم. ضمن علامة تبويب الأداة ، حدد وحدة التحكم في العدادات. حدد آلة التضخيم ثم انقر فوق زر فتح الباب.

ضع لوحة التضخيم في الفتحة الأولى لمحول اللوحة ، وتحقق من أن المحول مصطف بشكل صحيح مع واحد في الزاوية اليسرى العليا. قم بتوجيه اللوحة بحيث يكون الرمز الشريطي متجها لأعلى ونحو مقدمة الجهاز. بعد النقر فوق زر إغلاق الباب ، انتقل إلى علامة التبويب الرئيسية في أسفل الشاشة.

ضمن قائمة التشغيل، حدد OpenArray. انقر فوق الحصول على معرفات اللوحة. لبدء التشغيل ، انقر فوق بدء التشغيل.

افتح جدول بيانات يحتوي على ماكرو النتائج. في ملف البيانات المصدرة ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق علامة التبويب الموجودة أسفل الشاشة وحدد نقل أو نسخ. في حقل إلى الحجز، حدد ماكرو النتائج.

ثم انقر فوق نقل للإنهاء وحدد المربع المسمى إنشاء نسخة. أخيرا ، انقر فوق موافق. احذف علامة تبويب التصدير القديمة ثم أعد تسمية علامة التبويب المضافة حديثا باسم تصدير.

انقر فوق عرض ثم وحدات ماكرو، وحدد ماكرو، ثم انقر فوق تشغيل. بعد ذلك ، كرر هذا ل Macro2 بالنقر فوق عرض ثم وحدات الماكرو ، وتحديد Macro2 والنقر فوق تشغيل. في برنامج آلة التضخيم ، تحقق من المنحنيات لكل عينة وتحكم في الجدول الكلي عن طريق تحديد مخطط التحليل / التضخيم على الجانب الأيسر من الشاشة.

بعد ذلك ، حدد علامة تبويب العينة وانقر فوق كل عينة للتأكد من وجود منحنيات تضخيم موجبة أو ثلاثة لكل نتيجة من النتائج الإيجابية في الجدول. يتم رسم قراءات التألق مقابل دورات التضخيم لتوضيح أن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي قد تم إجراؤه بنجاح. وصلت معظم العينات إلى مستويات عتبة نسبية بين الدورتين الثانية و 25 من تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي.

يتم رسم المنحنيات القياسية التي تعمل على ثلاثة أيام مختلفة لإثبات الخطية ونطاق التضخيم باستخدام عناصر التحكم الإيجابية. يتم رسم قيم عتبة الدورة مقابل قاعدة السجل 10 من عدد نسخ معيار الحمض النووي. سيقوم الماكرو بملء أسماء العينات في العمود الأول ومتوسط قيم Ct الثلاث لكل هدف لأولئك الذين لديهم نتائج إيجابية.

تظهر الأهداف التي لم يتم تضخيمها فارغة في هذا الجدول. يتم عرض النتائج الكمية ل 10 عينات سريرية وأربعة ضوابط روتينية ، كما هو الحال هنا ، يجب أن يكون التحكم في التضخيم السلبي سلبيا لجميع الأهداف ويجب أن يحتوي التحكم في الاستخراج السلبي على التحكم الداخلي فقط. تظهر عينة واحدة في هذه المجموعة فشلا في التحكم الداخلي ، مما يشير إلى وجود مثبطات في العينة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تجربة تفاعل البوليميراز المتسلسل النانوي. سيسهل هذا الإجراء تشغيل اللوحات القائمة على المتلازمة في التشخيص البيطري. يمكن تكييف هذه الطريقة لتشمل مقالات عن العوامل المسببة للعديد من الأمراض المعدية المختلفة.