توليف Cationized Magnetoferritin للمغنطة فائقة السرعة من الخلايا

الهدف العام من هذه الطريقة هو تخليق جسيم نانوي مغناطيسي داخل قفص بروتيني، ثم وظيفية البروتين بحيث يسمح بالارتباط السريع للجسيم النانوي المغناطيسي بالخلايا. يمكن استخدام هذه الطريقة لإنتاج جسيمات نانوية مغناطيسية تتيح وسم الخلايا مغناطيسياً بشكل سريع وفعال، وهو أمر ضروري لتطبيقات مثل التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) أو فصل الخلايا مغناطيسياً. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية تحقيق مغنطة الخلايا باستخدام تركيزات منخفضة من الجسيمات النانوية وفترات تحضين قصيرة، مما يمنع الآثار الضارة المحتملة الناتجة عن التعرض للجسيمات النانوية.

للبدء، قم بإزالة الأكسجين من 500 milliliters من الماء منزوع الأيونات عن طريق وضع أنبوب متصل بأسطوانة غاز النيتروجين في الماء وإغلاق الوعاء بغشاء بلاستيكي لاصق. بعد ذلك، قم بتمرير فقاعات غاز النيتروجين لمدة 60 minutes تقريبًا. قم بتسخين حمام مائي متصل بوعاء التفاعل مزدوج الجدار إلى 65 °C.

بعد ذلك، أضف 75 milliliters من محلول HEPES المنظم بتركيز 50 millimolar، وpH 8.6 إلى وعاء التفاعل. أغلق الوعاء بإحكام وقم بإزالة الأكسجين عن طريق تمرير غاز النيتروجين عبر المحلول المنظم لمدة 20 دقيقة تقريباً. وفي الوقت ذاته، قم بتحريك المحلول المنظم باستخدام محرك مغناطيسي.

بعد إزالة الأكسجين من محلول منظم HEPES، أخرج أنبوب النيتروجين من المنظم، مع إبقائه معلقاً فوق المحلول للحفاظ على جو من النيتروجين. أضف apoferritin للوصول إلى تركيز نهائي قدره 3 mg/mL. استمر في التقليب المغناطيسي، ولكن قلل سرعة التقليب في حالة حدوث رغوة.

لتخليق الماجنيتوفيريتين، استخدم مضختين حقنيتين لحقن 10.1 milliliters من السلائف الحديدية-الكوبالتية، و 10.1 milliliters من بيروكسيد الهيدروجين في وقت واحد داخل محلول الأبوفيريتين بمعدل تدفق قدره 0.15 milliliters في الدقيقة. استكمل خطوات التخليق كما هو موضح في البروتوكول النصي. بعد ذلك، قم بتحميل العينة على عمود يحتوي على مصفوفة كاتيونية باستخدام مضخة تمعجية بمعدل تدفق قدره 10 milliliters في الدقيقة.

اغسل العمود بحوالي 100 milliliters من محلول التسييل (running buffer) باستخدام مضخة تدرج بمعدل تدفق قدره 10 milliliters في الدقيقة. ولشطف البروتين، اغسل العمود بـ 150 milliliters من تراكيز متزايدة من كلوريد الصوديوم ومحلول tris buffer بمعدل 10 milliliters في الدقيقة. وعند شطف البروتين عند تركيز كلوريد الصوديوم البالغ 500 millimolar، اجمعه في أجزاء سعة كل منها 50 milliliter باستخدام جامع أجزاء آلي.

قم بتركيز 150 milliliters من الماجنيتوفيريتين (magnetoferritin) لتصل إلى حجم يقارب 2 milliliters باستخدام وحدة ترشيح طرد مركزي سعة 15 milliliter، تليها وحدة سعة 4 milliliters. يرجى الرجوع إلى تعليمات الشركة المصنعة لوحدات الترشيح بالطرد المركزي للحصول على بروتوكول مفصل لهذا الإجراء. بعد ذلك، قم بتحميل العينة المركزة على عمود ترشيح هلامي باستخدام حلقة حقن.

اغسل العمود باستخدام محلول منظم للجريان بمعدل تدفق قدره 1.3 milliliters per minute. اجمع أجزاءً بحجم ستة milliliter باستخدام جامع أجزاء آلي. تخرج المونومرات البروتينية في النهاية.

في هذه المرحلة، يمكن تخزين الماغنيتوفرتين المُنقى عند درجة حرارة 4 °C حتى مرحلة الكاتيونة. لكل 10 mg من الماغنيتوفرتين، يتم وزن 374 mg من DMPA وإذابتها في 2.5 mL من محلول MES المنظم بتركيز 200 mM. يتم ضبط pH المحلول ليصل إلى 7 تقريبًا باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز.

تتصاعد أبخرة سامة عند ضبط الرقم الهيدروجيني (pH) لمحلول DMPA باستخدام حمض الهيدروكلوريك. لذا، يجب التعامل مع هذه المواد داخل خزانة استرداد الأبخرة (fume hood). أضف 2.5 milliliters من محلول magnetoferritin بتركيز أربعة milligrams per milliliter.

أضف محركاً مغناطيسياً وقم بالتحريك لمدة ساعتين للوصول إلى حالة التوازن. وبعد ضبط درجة حموضة المحلول لتصل إلى pH 5.0، أضف 141 milligrams من مسحوق EDC إلى محلول DMPA magnetoferritin. استمر في التحريك لمدة ثلاث ساعات ونصف.

قم بترشيح المحلول باستخدام مرشح حقنة بمسامية 0.22 micron لإزالة أي رواسب، ثم قم بعملية ديالة البروتين كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. استنبت الخلايا الجذعية الميزنكيمية البشرية hMSCs وفقاً لما ورد في البروتوكول المكتوب. اغسل الخلايا المزروعة بملليلترين من محلول PBS في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، أضف 1 ml من محلول الماغنيتوفيريتين الموجب (cationized magnetoferritin) المعقم إلى الخلايا المزروعة قبل تحضينها للفترة الزمنية المطلوبة. اغسل الخلايا باستخدام PBS، ثم قم بحصادها عن طريق إضافة 0.5 ml من Trypsin-EDTA والتحضين عند 37 °C لمدة خمس دقائق. بعد إضافة 1 ml من وسط الزرع لإبطال مفعول Trypsin-EDTA، انقل المحلول إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ml وقم بإجراء الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 524 ×g. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا في 0.5 ml من منظم الفصل المغناطيسي (magnetic separation buffer).

بعد ذلك، قم بتثبيت المغناطيس على الحامل المتعدد وأضف عمود فصل مغناطيسي إلى المغناطيس. ضع مرشح ما قبل الفصل على العمود. ثم، أضف 0.5 milliliters من محلول الفصل المغناطيسي المنظم إلى مرشح ما قبل الفصل، واتركه يمر عبر كل من المرشح والعمود لغسلهما.

بعد ذلك، ضع أنبوب طرد مركزي سعة 15 milliliter أسفل العمود، وأضف 0.5 milliliters من معلق الخلايا إلى خزان الترشيح الخاص بعمود الفصل المغناطيسي. وعندما يفرغ الخزان، أضف 0.5 milliliters من منظم الفصل المغناطيسي. وعندما يفرغ الخزان مرة أخرى، أضف 0.5 milliliters أخرى من منظم الفصل المغناطيسي.

كرر عملية الغسل مرة أخرى، ليصل الحجم الإجمالي من محلول الفصل المغناطيسي المنظم إلى 1.5 milliliters. تعمل خطوة الغسل هذه على شطف جميع الخلايا غير المغناطيسية من العمود. قم بإزالة العمود من المغناطيس وضعه في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 milliliter.

بعد ذلك، قم بإزالة المرشح من خزان العمود. أضف 1 milliliter من منظم الفصل المغناطيسي إلى الخزان، وقم بدفعه فوراً عبر العمود باستخدام المكبس المورد من الشركة المصنعة. يؤدي ذلك إلى شطف الخلايا الممغنطة من العمود إلى أنبوب الطرد المركزي.

باشر بإجراء تقدير كمية الحديد كما هو موضح في البروتوكول النصي. أظهرت صور المجهر الإلكتروني النافذ لعينات الماغنيتو-فيريتين (magnetoferritin) المصبوغة سلبياً أن الجسيمات النانوية قد تشكلت داخل القفص البروتيني. وتؤكد قياسات جهد زيتا (Zeta potential) أن الماغنيتو-فيريتين اكتسب شحنة سطحية موجبة بعد عملية الكاتيونية.

أدى تعريض الخلايا الجذعية الميزنشيمية البشرية للمغنتوفرتين المكتن بـ "كاتيونات" لمدة دقيقة واحدة إلى مغنطة 92% من تعداد الخلايا وإيصال 3.6 picograms من الحديد لكل خلية. وقد أدى زيادة وقت التحضين إلى 15 دقيقة إلى مغنطة تعداد الخلايا بالكامل. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة بكيفية تخليق جسيم نانوي مغناطيسي داخل تجويف الأبوفيريتين من خلال الإضافة المتتالية لسلائف أملاح المعادن إلى محلول البروتين.

ومن ثم، كيفية إجراء عملية الكاتيونة الكيميائية للبروتين باستخدام اقتران TMPA. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن إتمام تخليق الماجنيتوفيريتين وتنقيته وعملية الكاتيونة في غضون ثلاثة أيام إذا نُفذت الإجراءات بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تجنب التلوث بالأكسجين والحفاظ على درجة الحرارة والـ pH الصحيحين طوال فترة تخليق الماجنيتوفيريتين.

استكمالاً لهذا الإجراء، يمكن تغليف شحنات أخرى مثل النقاط الكمومية أو العوامل العلاجية داخل قفص الأبوفيريتين الموجون، وذلك لتحقيق توصيل أكثر كفاءة لتلك المواد إلى الخلايا. يمكن لهذه التقنية أن تمهد الطريق للباحثين في مجال المعالجة المغناطيسية للخلايا لاستكشاف الوسم المغناطيسي في الخلايا التي تظهر امتصاصاً ضعيفاً للجسيمات النانوية، أو تلك التي تكون حساسة جداً للتعرض المطول للجسيمات النانوية أو لتركيزاتها المرتفعة.