توليف Cationized Magnetoferritin للمغنطة فائقة السرعة من الخلايا

الهدف العام من هذه الطريقة هو تصنيع جسيم نانوي مغناطيسي داخل قفص بروتيني ثم إضفاء طابع وظيفي على البروتين بحيث يتيح الارتباط السريع للجسيم النانوي المغناطيسي بالخلايا. يمكن استخدام هذه الطريقة لتوليد الجسيمات النانوية المغناطيسية التي تتيح وضع العلامات المغناطيسية بسرعة وكفاءة للخلايا ، وهو أمر مهم لتطبيقات مثل التصوير بالرنين المغناطيسي أو فصل الخلايا المغناطيسية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تحقيق مغنطة الخلية باستخدام تركيزات منخفضة من الجسيمات النانوية وأوقات حضانة قصيرة ، مما يمنع الآثار الضارة المحتملة بسبب التعرض للجسيمات النانوية.

للبدء ، قم بإزالة الأكسجين من 500 مل من الماء منزوع الأيونات عن طريق وضع أنبوب متصل بأسطوانة غاز النيتروجين في الماء وإغلاق الوعاء بغشاء بلاستيكي. ثم ، قم بفقاعة غاز النيتروجين لمدة 60 دقيقة تقريبا. قم بتسخين حمام مائي متصل بوعاء التفاعل ذو الغلاف المزدوج إلى 65 درجة مئوية.

ثم أضف 75 ملليلترا من محلول HEPES 50 ملمولار، ودرجة الحموضة 8.6 في وعاء التفاعل. أغلق الوعاء وقم بإزالة الأكسجين عن طريق فقاعات غاز النيتروجين من خلال المحلول العازل لمدة 20 دقيقة تقريبا. في الوقت نفسه ، حرك محلول العازلة باستخدام محرك مغناطيسي.

بعد إزالة الأكسجين من محلول HEPES العازل ، قم بإزالة أنبوب النيتروجين من المخزن المؤقت ، مع إبقائه معلقا فوق المحلول للحفاظ على جو النيتروجين. أضف الأبوفيريتين لتحقيق تركيز نهائي قدره 3 ملليغرام لكل ملليلتر. استمر في التقليب المغناطيسي ، لكن قلل من سرعة التقليب في حالة حدوث رغوة.

لتخليق المغنطيسفوريتين ، استخدم مضختين حقاقتين لحقن 10.1 مل من سلائف الحديد والكوبالت في وقت واحد ، و 10.1 ملليلتر من بيروكسيد الهيدروجين في محلول الأبوفيريتين بمعدل تدفق 0.15 ملليلتر في الدقيقة. تابع خطوات التوليف كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك ، قم بتحميل العينة على عمود يحتوي على مصفوفة كاتيونية باستخدام مضخة تمعجية بمعدل تدفق 10 ملليلتر في الدقيقة.

اغسل العمود بحوالي 100 مل من المخزن المؤقت للتشغيل باستخدام مضخة متدرجة بمعدل تدفق 10 ملليلتر في الدقيقة. لتصفية البروتين ، اغسل العمود ب 150 مل من التركيزات المتزايدة من كلوريد الصوديوم ومخزن ثلاثي بمعدل 10 ملليلتر في الدقيقة. عندما يمحى البروتين بتركيز كلوريد الصوديوم 500 مللي مولار ، اجمعه في أجزاء 50 مليلتر باستخدام مجمع الكسر الآلي.

ركز 150 مل من المغناطيس الفيريتين على حجم حوالي ملليلترين باستخدام وحدة مرشح طرد مركزي سعة 15 مليلتر متبوعة بوحدة حجم أربعة ملليلتر. راجع تعليمات الشركة المصنعة لوحدات مرشح الطرد المركزي للحصول على بروتوكول مفصل لهذا الإجراء. بعد ذلك ، قم بتحميل العينة المركزة على عمود ترشيح هلام باستخدام حلقة حقن.

اغسل العمود بمخزن مؤقت قيد التشغيل بمعدل تدفق 1.3 مل في الدقيقة. اجمع ستة أجزاء ملليلتر باستخدام مجمع الكسور الآلي. مونومرات البروتين تتخلص أخيرا.

في هذه المرحلة ، يمكن تخزين المغنطيسية المنقاة عند أربع درجات مئوية حتى التقتينة. للحصول على 10 ملليغرام من المغناطيس ، قم بوزن 374 ملليغرام من DMPA وقم بإذابته في 2.5 ملليلتر من 200 ملليمولار MES المؤقت. اضبط درجة الحموضة في المحلول إلى سبعة تقريبا باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز.

يتم إطلاق الأبخرة السامة عند ضبط درجة الحموضة لمحلول DMPA بحمض الهيدروكلوريك. تأكد من التعامل مع هذه المواد في غطاء الدخان. أضف 2.5 مل من محلول المغنطيسفوريتين بمعدل أربعة ملليغرام لكل ملليلتر.

أضف أداة تقليب مغناطيسية وقلبي لمدة ساعتين حتى يتوازن. بعد ضبط المحلول على درجة الحموضة 5.0 ، أضف 141 ملليغرام من مسحوق EDC إلى محلول DMPA magnetoferritin. استمر في التقليب لمدة ثلاث ساعات ونصف.

قم بتصفية المحلول من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرون لإزالة أي رواسب وغسيل البروتين كما هو موضح في بروتوكول النص. ثقافة hMSCs كما هو موضح في بروتوكول النص. اغسل الخلايا المطلية بملليلترين من PBS بدرجة حرارة الغرفة.

ثم أضف ملليلترا واحدا من محلول المغناطيس الموجبة المعقم إلى الخلايا المطلية قبل احتضانها للفترة الزمنية المطلوبة. اغسل الخلايا باستخدام PBS ، ثم احصدها بإضافة 0.5 مل من Trypsin-EDTA واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد إضافة مليلتر واحد من وسط الثقافة لتعطيل التربسين EDTA ، انقل المحلول إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر وجهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق عند 524 مرة G. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 0.5 مل من المخزن المؤقت للفصل المغناطيسي.

بعد ذلك ، قم بتوصيل المغناطيس بالحامل المتعدد وأضف عمود فصل مغناطيسي إلى المغناطيس. ضع عامل تصفية فصل مسبق على العمود. بعد ذلك ، أضف 0.5 مل من المخزن المؤقت للفصل المغناطيسي إلى مرشح الفصل المسبق ، واتركه يمر عبر كل من الفلتر والعمود لغسلهما.

بعد ذلك ، ضع أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر أسفل العمود وأضف 0.5 مل من تعليق الخلية إلى خزان المرشح لعمود الفصل المغناطيسي. عندما يكون الخزان فارغا ، أضف 0.5 مل من المخزن المؤقت للفصل المغناطيسي. عندما يفرغ الخزان مرة أخرى ، أضف 0.5 مل أخرى من المخزن المؤقت للفصل المغناطيسي.

كرر الغسيل مرة أخرى ، للحصول على حجم إجمالي من المخزن المؤقت للفصل المغناطيسي يبلغ 1.5 ملليلتر. تعمل خطوة الغسيل هذه على التخلص من جميع الخلايا غير الممغنطة من العمود. قم بإزالة العمود من المغناطيس وضعه في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل.

ثم قم بإزالة المرشح من خزان العمود. أضف 1 مليلتر من المخزن المؤقت للفصل المغناطيسي إلى الخزان ، وادفع على الفور عبر العمود باستخدام المكبس الذي توفره الشركة المصنعة. هذا يمحو الخلايا الممغنطة من العمود إلى أنبوب الطرد المركزي.

تابع إجراء القياس الكمي للحديد كما هو موضح في بروتوكول النص. أظهرت صور المجهر الإلكتروني للإرسال لعينات المغناطيس الفيريتين الملطخة بالسلبية أن الجسيمات النانوية قد تشكلت داخل قفص البروتين. تؤكد قياسات Zeta المحتملة أن المغناطيس الفيريتين حصل على شحنة سطحية موجبة بعد التقيونية.

أدى تعريض الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية للمغناطيس الفيريتين الكاتيوني لمدة دقيقة واحدة إلى مغنطة 92٪ من سكان الخلايا وتوصيل 3.6 بيكوغرام من الحديد لكل خلية. أدت زيادة وقت الحضانة إلى 15 دقيقة إلى مغنطة مجموعة الخلايا بأكملها. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم لكيفية تصنيع جسيم نانوي مغناطيسي داخل تجويف الأبوفيريتين عن طريق إضافة سلائف الملح المعدنية بالتتابع إلى محلول البروتين.

وبعد ذلك ، كيفية تأين البروتين كيميائيا باستخدام اقتران TMPA. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تخليق المغناطيس والفينيق والتنقية والتأين في غضون ثلاثة أيام إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم تجنب تلوث الأكسجين والحفاظ على درجة الحرارة الصحيحة ودرجة الحموضة طوال عملية تخليق المغنطيس.

بعد هذا الإجراء ، يمكن تغليف شحنات أخرى مثل النقاط الكمومية أو العوامل العلاجية في قفص الأبوفيريتين الموجبة لتحقيق توصيل أكثر كفاءة لتلك المواد إلى الخلايا. يمكن لهذه التقنية أن تمهد الطريق للباحثين في مجال التلاعب بالخلايا المغناطيسية لاستكشاف الملصقات المغناطيسية في الخلايا التي تظهر امتصاصا ضعيفا للجسيمات النانوية أو التي تكون حساسة جدا للتعرض لفترات طويلة للجسيمات النانوية أو تركيزات الجسيمات النانوية المرتفعة.