SILAC القائم [بروتيوميك توصيف Exosomes من HIV-1 الخلايا المصابة

الهدف العام من هذا الإجراء هو توصيف البروتين الخارجي من الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي في مجال بيولوجيا الإكسوسوم مثل تأثير الضغوط الخارجية على تكوين بروتين الإكسوسوم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تعلمها حتى مع وجود خلفية محدودة في علم البروتينات وبيولوجيا الإكسوسوم.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على دراسات الأمراض الأخرى مثل الالتهابات البكتيرية. يتم استخدام خط الخلايا H9 في هذه التجربة على الرغم من أنه يمكن استخدام خطوط الخلايا المختلفة طالما أنها في مرحلة التكاثر النشط وعرضة لحالة الاختبار المختارة. قم بالبذور مرتين في 10 إلى المرحلة السادسة تسع خلايا في كل من قارورتي زراعة الخلايا.

قم بزراعة مجموعة واحدة في 10 ملليلتر من الوسط المسمى الذي يحتوي على 10٪ FBS منمق ، و 100 ملليغرام لكل لتر L-lysine المسمى C13 ، و 100 ملليغرام لكل لتر C13 و N15 المسمى L-arginine. قم بزيادة السكان الآخرين في 10 ملليلتر من الوسط غير المسمى مع 10٪ منمق FBS و L-lysine و L-arginine. قم بتنمية الخلايا لستة مضاعفات ، وعند هذه النقطة تكون بروتينات الخلايا في الوسط المسمى أكثر من 99٪ مصنفة بالأحماض الأمينية الثقيلة.

أضف وسائط جديدة أو قم بتغيير الوسائط على فترات زمنية منتظمة حسب نوع الخلايا. في نهاية وضع العلامات ، قم بزيادة حجم المزرعة إلى 30 مل لاستيعاب نمو المزيد من الخلايا. إصابة الخلايا المصنفة بسلالة NL4-3 من فيروس نقص المناعة البشرية -1 باستخدام بروتوكول قياسي لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية -1.

أضف كمية مناسبة من الفيروس إلى الخلايا واحتضن لمدة 48 ساعة بينما تستمر الخلايا غير المسماة في النمو في وسط غير مصنف بدون عدوى فيروس نقص المناعة البشرية -1. في نهاية عدوى فيروس نقص المناعة البشرية -1 ، يتم حصاد المواد الطاففية من كلا مجموعتي الخلايا لعزل الإكسوسوم. اجمع المواد الطافية للثقافات في أنابيب مخروطية سعة 50 مليلتر لتجنب الخلايا.

جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 300 مرة جم وأربع درجات مئوية لإزالة الخلايا المتبقية. اجمع المواد الطافية في أنابيب مخروطية جديدة سعة 50 مليلتر وأجهزة طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 2 ، 000 مرة جم لإزالة الخلايا الميتة. انقل المواد الطافية الناتجة إلى أنابيب تجارية متوافقة مع الدوار قادرة على تحمل الطرد المركزي الفائق.

تأكد من موازنة أنابيب الطرد المركزي الفائقة. الطرد المركزي الأنابيب لمدة 30 دقيقة عند 10 ، 000 مرة جم لإزالة بقايا الخلية. اجمع المواد الطافية في أنابيب جديدة لأجهزة الطرد المركزي الفائقة.

جهاز طرد مركزي لمدة 70 دقيقة عند 100 ، 000 مرة ، تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق كل حبيبات غنية بالإكسوسوم في خمسة ملليلتر من PBS الطازج وانقل المحلول إلى أنبوب طرد مركزي فائق جديد.

جهاز الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 70 دقيقة عند 100 ، 000 مرة ز. بعد الدوران النهائي ، تخلص من المادة الطافية. حبيبات الخلية جاهزة الآن لاستخراج البروتين.

لبدء هذا الإجراء ، قم بإذابة كل حبيبات خارجية معزولة في 100 إلى 200 ميكرولتر من fer-pa-lai-ses ومخزن الاستخراج مع مثبطات البروتياز المضافة التي يمكن أن تمنع مجموعة كاملة من البروتيازات. الطرد المركزي المحاليل الذائبة لمدة 10 دقائق عند 13 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية. انقل المواد الطافية التي تم تطهيرها إلى أنابيب جديدة من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل.

بعد تحديد تركيز البروتين لكل عينة بواسطة المقايسات القياسية ، امزج كميات متساوية من البروتينات من العينات المصنفة وغير المصنفة. مرري الخليط المتساوي على جل SDS-PAGE من أربعة إلى 20٪ لمدة 30 دقيقة. تلطخ الجل باللون الأزرق Coomassie متبوعا بإزالة الصبغة.

باستخدام شفرة حلاقة ، قم بقص حارة العينة من الجل ، ثم قم بتقطيع حارة الجل إلى 10 إلى 15 قطعة متساوية. ضع كل قطعة في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر ليصبح المجموع من 10 إلى 15 أنبوبا ، واستمر في إجراء استخراج البروتين كما هو موضح في بروتوكول النص. لن يتم إثبات إجراءات تحليل البيانات البروتينية ولكن يتم تلخيصها في هذا المخطط الانسيابي.

يتم تحليل البروتينات المستخرجة أولا عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة ، والتحليل الطيفي الكتلي الترادفي ، ويتم تقييم جودة البيانات. بعد ذلك ، تتم معالجة البيانات مسبقا عن طريق إزالة البروتينات التي تحتوي على أقل من ببتيدات كميين. ثم يتم تحديد البروتينات

أخيرا ، تتم مقارنة التكرارات للمرشحين المهمين لتحقيق الاتساق ، ويتم دمج البيانات من جميع النسخ المتماثلة. لبدء توصيف البروتينات المحددة ، استخدم أرقام انضمام GenBank أو معرفات UniProt للبحث في قواعد بيانات الإكسوسوم الحالية. سيتم استخدام ExoCarta في هذا العرض التوضيحي.

انقر فوق الاستعلام وأدخل إما اسم الجين أو البروتين أو رقم الانضمام. أي دليل في الإكسوسومات يتحقق من أن البروتينات المرشحة قد تم العثور عليها سابقا في الإكسوسومات ويضيف طبقة من الثقة في أن المرشحين موجودون بالفعل في الإكسوسومات. بعد ذلك ، ابحث في المرشحين مقابل قاعدة بيانات تفاعل فيروس نقص المناعة البشرية -1 والبروتين البشري.

في إدخال اسم نطاق البروتين، أدخل أسماء المرشح أو أرقام الانضمام، وانقر فوق بحث. يمكن أن توفر نتائج البحث نظرة ثاقبة للتفاعلات بين فيروس نقص المناعة البشرية -1 والبروتين المرشح ، وتشير إلى أي من المرشحين قد يكون مرتبطا حقا بفيروس نقص المناعة البشرية -1. تتمثل الخطوة الثالثة في اكتساب نظرة عالمية على المرشحين باستخدام علم الأنطولوجيا الجيني أو برنامج تحليل GO مثل fun-brich.

ضمن تحليل الإثراء ، انقر فوق إضافة مجموعة بيانات وقم بتحميل أرقام انضمام GenBank أو معرفات UniProt للمرشحين ، ثم حدد نوع المخطط لتصور تحليل GO. يتم تصور نتيجة تحليل GO في شكل مخططات دائرية توفر معلومات حول البروتينات المرشحة في مجالات العملية البيولوجية والمكون الخلوي والوظيفة الجزيئية. تتمثل الخطوة التالية في تحديد مصطلحات GO الممثلة بشكل مفرط إحصائيا عبر تحليل DAVID.

انقر فوق أداة التعليقات التوضيحية الوظيفية ، وأدخل قائمة المرشحين ، وحدد معرف الجين مثل UniProt ID.حدد قائمة الجينات وابحث. عند اكتمال البحث ، انقر فوق صفحة نتائج ملخص التعليقات التوضيحية ضمن فئة الأنطولوجيا الجينية لعرض مصطلحات GO المخصبة وقيم p والمعلمات الأخرى. أخيرا ، تحقق من التفاعلات المحتملة بين البروتين والبروتين والمسارات الكيميائية الحيوية المحتملة باستخدام قاعدة بيانات STRING التي يمكن الوصول إليها بشكل مفتوح.

أدخل معرف البروتين أو التسلسل في مربع البحث المخصص وحدد الأنواع الصحيحة للتحليل. انقر على بحث. ستعطي النتائج معلومات عن الارتباطات المباشرة وغير المباشرة.

يجب النظر في أفضل 10 تطابقات معروفة للمرشح الخارجي المعروضة في النتائج لاختيار مرشح مهم. يتم عرض نتائج تمثيلية من تحليل DAVID لمجموعة من 14 بروتين. أشار تخصيب العملية البيولوجية إلى أن العمليات المرتبطة بموت الخلايا يتم إثراؤها بشكل كبير.

يظهر إثراء المكون الخلوي العديد من البروتينات ذات الأصل داخل الخلايا ، وحدد إثراء الوظيفة الجزيئية دورا في ارتباط البروتين لمعظم المرشحين. تم اختيار سلسلة نازعة هيدروجين L-lactate B أو LDHB كأهم مرشح ، وحدد تحليل STRING أفضل 10 شركاء متفاعلين ل LDHB. كانت غالبية شركاء LDHB مرتبطين وظيفيا ومكانيا بالإكسوسومات في فيروس نقص المناعة البشرية -1.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أسبوع واحد إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تنفيذ كل خطوة في درجة الحرارة والحالة المناسبة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل عزل التقارب من أجل تأكيد تنبؤات تحليل المعلوماتية الحيوية.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للأبحاث في المجال الخارجي لاستكشاف التغيرات في البروتين الخارجي المرتبط بعدوى فيروس نقص المناعة البشرية -1 في علم الأحياء. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الإكسوسوم من زراعة الخلايا ، وتحليل بروتيناتها ، والتحقيق في ارتباطها بفيروس نقص المناعة البشرية. لا تنس أن العمل مع فيروس نقص المناعة البشرية أو أي عامل معدي آخر يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.