إعداد الثقافات الدبقية المختلطة الابتدائية من الكبار ماوس النخاع الشوكي الأنسجة

تطوير ألم الاعتلال العصبي وتشمل التغيرات المرضية للخلايا الحبل الشوكي الدبقية. نظام الثقافة الدبقية موثوقة مستمدة من أنسجة الحبل الشوكي الكبار ومصممة لدراسة هذه الخلايا في المختبر غير متوفرة. لذلك، نعرض هنا كيفية تأسيس الثقافات الدبقية المختلطة الابتدائية من الماوس الكبار نسيج الحبل الشوكي.

الهدف العام من هذا البروتوكول هو إنشاء مزارع دبقية مختلطة أولية من الحبال الشوكية للفئران البالغة للدراسات المختبرية. توفر لنا هذه الطريقة نظاما في المختبر للتحقيق في أدوار الخلايا الدبقية في الأمراض العصبية التي تنطوي على تغيرات مرضية داخل الحبل الشوكي ، مثل آلام الأعصاب والتصلب المتعدد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الثقافات الدبقية يتم تحضيرها من الحبل الشوكي للفأر البالغ ، مما يوفر نظاما يعكس بشكل أكثر دقة الظروف في الجسم الحي.

ستظهر الإجراء جينيفر مالون ، فنية من مختبري. من خلال العمل في غطاء لزراعة الأنسجة ، قم بنقل أربعة حبال شوكية للفأر إلى طبق بتري من HBSS. استخدم مقصا وملقطا معقما لتقطيع كل من الحبل الشوكي إلى قطع صغيرة.

بعد ذلك ، انقل القطع إلى أنبوب مخروطي الشكل 50 ملم يحتوي على خليط إنزيم غراء DNAse. تجنب نقل HBSS إلى خليط الإنزيم ، فقد يؤدي ذلك إلى انخفاض أداء الإنزيم. من الأهمية بمكان أن يتم هضم قطع الأنسجة جيدا للحصول على معلق خلية واحدة.

ومع ذلك ، فإن الهضم المفرط سيؤدي إلى عدد أقل من الخلايا القابلة للحياة. يحتاج كل مختبر إلى إجراء اختبارات تجريبية لتحديد وقت الهضم الدقيق بناء على ما هو الأفضل لخلاياهم. بعد ذلك ، قم بدوامة الأنبوب برفق ثم احتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز المداري بمعدل 150 دورة في الدقيقة.

بعد الحضانة ، قم بتدوير الأنبوب ، ثم قم بعمل ثلاثية الأنسجة بقوة باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر لتعزيز المزيد من التفكك. بعد ذلك ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وجهاز طرد مركزي لمدة 300 × جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أثناء الطرد المركزي ، عند 300 ميكرولتر من محلول مثبط الألبومين المعاد تكوينه إلى 2.7 مل من ABSS في أنبوب معقم وتخلط جيدا.

ثم أضف 150 ميكرولتر من محلول DNAse. بعد النقد المراقب ، قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في مثبط الألبومين الملقب حديثا ومحلول DNAse. دوامة جيدا لكسر بيليه الخلية.

بعد ذلك ، أضف ثلاثة ملليلتر من محلول مثبط البيضات المعاد تكوينه ، بدون DNAse ، إلى تعليق الخلية. الطرد المركزي للخلايا عند 70 × جم لمدة ست دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الدوران ، قم بإزالة المادة الطافية ، التي تحتوي على شظايا الغشاء ، واحتفظ بالحبيبات.

لإزالة المايلين من خلايا الحبل الشوكي المنفصلة ، أضف أولا ثمانية ملليلتر من درجة حرارة الغرفة 20٪ متوسطة كثافة التدرج في الأنبوب الذي يحتوي على حبيبات الخلية والدوامة برفق. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 800 × جم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون أن تنكسر. بعد الطرد المركزي ، قم بسحب الطبقة العليا من الحطام بعناية ، والتي تحتوي في الغالب على المايلين والمادة الطافية ، تاركة الحبيبات.

لإزالة أي تدرج كثافة متبقي ، اغسل الخلايا عن طريق تعليق الحبيبات بثمانية ملليلتر من cDMEM المخفف باستخدام HBSS. الطرد المركزي للخلايا على حرارة 400 جرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية ، واغسل الخلايا ب cDMEM المخفف كما كان من قبل.

بعد إزالة المادة الطافية ، يمكن تخزين الحبيبات على الجليد حتى زرع الخلايا. بمجرد أن تصبح جاهزا للطلاء ، أعد تعليق الخلايا في 14 مل من cDMEM ، مكملا ب 2-Mercaptoethanol. وأضف ملليلتر واحد من تعليق الخلية إلى كل بئر في طبق 12 بئر.

لوحة الآبار الإضافية التي يمكن استخدامها لتحديد متوسط عدد الخلايا لكل بئر ومحتوى الخلايا الدبقية الصغيرة للثقافة. بمجرد طلاء الخلايا ، احتضان الخلايا عند 35.9 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بتغيير الوسيط في اليوم 1 ، وهو اليوم التالي للطلاء.

بعض الخلايا متصلة بلوحة الثقافة ، لكنها لا تزال مستديرة في الغالب. هناك أيضا العديد من الخلايا العائمة والحطام الكبير. كرر تغيير الوسائط بعد ثلاثة إلى أربعة أيام حتى تصبح الخلايا جاهزة للعلاج بين اليومين 12 و 14.

تمت زراعة الخلايا الدبقية المختلطة من ستة فئران سوداء C57 بالغة إما عند 37 درجة مئوية أو 35.9 درجة مئوية وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. كما ترون ، لا يوجد فرق واضح في إجمالي مجموعات الخلايا في درجات الحرارة هذه. تظهر هذه المخططات التمثيلية مجموعات الخلايا الدبقية الصغيرة الإيجابية CD45 CD11b المعزولة عن إجمالي مجموعات الخلايا الموضحة سابقا.

يوضح هذا الشكل أنه يمكن الحصول على محتوى أعلى من الخلايا الدبقية الصغيرة عند زراعة الخلايا الدبقية المختلطة عند 35.9 درجة مئوية ، بدلا من 37 درجة مئوية. تم تحضير الحبل الشوكي البالغ ، الثقافات الدبقية المختلطة من C67 ستة فئران سوداء. يتم عرض صور تمثيلية للخلايا المستنبتة في الأيام الأول والرابع والثامن والثاني عشر.

الصور التي تظهر التقدم النموذجي للثقافة, فضلا عن إظهار أهمية وسائل الإعلام, تتغير في اليوم الأول مؤسسة ما بعد الثقافة. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال الإعداد الأولي لزراعة الخلايا الدبقية المختلطة في حوالي أربع ساعات ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد إنشاء ثقافة الخلايا الدبقية المختلطة ، يمكن الحصول على الثقافات المستنفدة للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الدبقية الصغيرة من هذه المجموعة المختلطة الأولية.

ومع ذلك ، فإن محصول الخلايا الدبقية الصغيرة سيكون محدودا ما لم يتم استخدام عدد كبير من الحبال الشوكية لإنشاء الثقافات. تم تصميم هذه التقنية في البداية للتحقيق في أدوار الخلايا الدبقية أثناء تطور آلام الأعصاب. ومع ذلك ، يمكن استخدامه لدراسة الأمراض العصبية الأخرى التي تنطوي على تغيرات مرضية داخل النخاع الشوكي للبالغين.