منهج في استخراج أصباغ من الحبار Doryteuthis pealeii

الهدف العام من هذا الإجراء هو وصف كيفية استخراج الأصباغ الموجودة داخل حبيبات النانو البنية للحبار التشريح حديثا ، Doryteuthis pealeii chromatophores. رأسيات الأرجل هي بحرية معقدة تخضع لتغييرات سريعة وقابلة للتكيف في لونها الجلدي. والتغيرات التكيفية في لونها الجلدي.

ومع ذلك ، لا يزال هناك الكثير غير معروف حول كيفية عمل هذه الأنظمة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستهدف على وجه التحديد الحبيبات ذات البنية النانوية في عضو الكروماتوفور. سيمكن هذا الباحثين من توضيح آلية تغيير اللون التي تنشأ على المقياس النانوي.

بالإضافة إلى نظرة ثاقبة في بيولوجيا رأسيات الأرجل ، يمكن أن يعلم تصميم الأنظمة الاصطناعية المصممة لتقليد النطاق الديناميكي للألوان التكيفية المعروضة في رأسيات الأرجل باستخدام جزيئات نانوية مصطبغة معبأة مسبقا. بشكل عام ، يكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن جمع أنسجة الكروماتوفور النقية أمر صعب بسبب قربه من الأنسجة المحيطة. تم تحسين طريقتنا لتقليل هذه الملوثات.

لبدء التشريح ، اسكب أولا ما يقرب من 250 مل من مياه البحر المفلترة في وعاء التشريح. ضع عينة في المقلاة واستخدم مقص مستقيم من الفولاذ المقاوم للصدأ ، مقطوعا من قاعدة الوشاح البطني على طول الجانب الخلفي للحيوان ، وينتهي في منطقة الزعنفة. قم بإزالة جميع الأعضاء الداخلية عن طريق رفعها برفق باستخدام ملقط تشريح وقطع النسيج الضام باستخدام المقص.

تخلص من الأعضاء في كيس عينة. باستخدام دبابيس T التشريح ، قم بتثبيت جانب زعنفة الوشاح لأعلى في وسادة التشريح. باستخدام الملقط ، قم بإزالة طبقة جلد البشرة المعتمة بعناية ، مع الحفاظ على طبقة الجلد المحتوية على الكروماتوفور سليمة.

تخلص من طبقة البشرة في كيس عينة. بعد ذلك ، قم بإزالة طبقة الكروماتوفور. قطع أنسجة الكروماتوفور إلى أقسام صغيرة سنتيمتر واحد في سنتيمتر واحد.

ضع الأقسام في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر ، واملأ كل أنبوب في منتصف الطريق بأنسجة تشريح. أخيرا ، أضف 500 ميكرولتر من مياه البحر المفلترة إلى الأنابيب. لعزل حبيبات الصباغ ، قم أولا بالطرد المركزي لأقسام أنسجة الكروماتوفور لمدة خمس دقائق عند 14 ، 000 × جم.

تخلص من الطبقة العليا من مياه البحر. أضف 500 ميكرولتر من محلول الكولاجيناز الباغراء إلى العينات والدوامة لمدة دقيقة إلى دقيقتين على أعلى إعداد. بعد ذلك ، صوتنة العينات لمدة خمس دقائق عند 40 كيلو هرتز لفصل الخلايا عن الأنسجة المحيطة.

جهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق أخرى عند 14،000 × جم ثم تخلص من المادة الطافية. كرر الطرد المركزي مرتين أخريين ، وتخلص من المادة الطافية في كل مرة. ثم أضف إعادة التعليق في الكولاجيناز.

استخدم الملقط لإزالة أي أجزاء كبيرة متبقية من الأنسجة لم يتم هضمها يدويا قبل المتابعة. يؤثر نقاء محلول الحبيبات على استخراج الصباغ. لذلك من المهم التأكد من هضم مواد الكروماتوفور الأولية بالكامل.

وجدنا أن أقسام الأنسجة التي تبلغ حوالي سنتيمتر واحد هي الأمثل لجمع أنقى مجموعات من الحبيبات. قم بإعداد مخزن التجانس عن طريق أخذ أنبوب غطاء لولبي سعة 150 مليلتر وإضافة الكمية المناسبة من HEPES وكلوريد المغنيسيوم وأسبارتات البوتاسيوم وديثيوثريتول. أضف قرصا صغيرا تجاريا واحدا من مثبط الإنزيم البروتيني.

باستخدام أسطوانة متدرجة ، قم بقياس 100 مل من الماء منزوع الأيونات وأضفه إلى الأنبوب الذي يحتوي على أملاح التجانس. قم بتدوير الأنبوب للخلط حتى يصبح المحلول صافيا. الطرد المركزي لعينات الأنسجة ثم تخلص من المادة الطافية.

أضف 500 ميكرولتر من مخزن التجانس إلى كل أنبوب ودوامة إلى دقيقتين لخلطها جيدا. قم بإجراء العينات لمدة 30 دقيقة عند 40 كيلو هرتز. ثم قم بالطرد المركزي لهم مرة أخرى.

بعد التخلص من المادة الطافية ، كرر إضافة التجانس ، والصوتنة ، والطرد المركزي مرتين إلى ثلاث مرات لضمان الهضم الكامل للأنسجة خارج الخلية. أخيرا ، يجب أن يحتوي الأنبوب على مادة طافية صفراء فاتحة وحبيبات حمراء اللون تتكون من حبيبات الصباغ المعزولة. تخلص من المادة الطافية.

أولا ، قم بإعداد الميثانول الحمضي للاستخراج في عينة زجاجية ذات غطاء لولبي عن طريق إضافة 5 مل من الميثانول و 25 مل من حمض الهيدروكلوريك المركز. حرك المحلول برفق حتى يمتزج. ضع جانبا أنبوب عينة واحد ، وسيكون هذا هو معالجة الحبيبات النهائية.

قم بإزالة مخزن التجانس من أنبوب ثان يحتوي على حبيبات. أضف 500 مل لتر من محلول الميثانول الحمضي إلى الأنابيب المتبقية والدوامة لمدة ثلاث إلى أربع دقائق. قم بتقطيع العينات لمدة 10 دقائق عند 40 كيلو هرتز ثم جهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 14000 × جم.

باستخدام ماصة دقيقة، اجمع المادة الطافية في قارورة زجاجية ذات سطح لولبي واحد درام. هذه هي الصبغة ، ويجب أن تظهر باللون الأحمر الداكن. كرر خطوات إضافة الميثانول الحمضي ، والصوتنة ، والطرد المركزي أربع إلى خمس مرات لجمع المادة الطافية حتى لا يتم استخراج المزيد من اللون.

الحبيبات عديمة اللون المتبقية هي حبيبات الصباغ المستخرجة. لتحضير عينات الحبيبات للتصوير ، قم أولا بجهاز الطرد المركزي لكل من الحبيبات غير المتفاعلة والحبيبات المستخرجة من الصباغ لمدة خمس دقائق عند 14000 × جم ، وتخلص من المادة الطافية ، ثم أعد تعليق كل حبيبات في 1 مل من 95٪ من الإيثانول. باستخدام ماصة النقل ، ضع 2-3 قطرات من كل تعليق حبيبي على كعب منفصل من الألومنيوم SEM.

ضع العينات في المجفف لتجف طوال الليل تحت الفراغ. قم بتغطية بذرة الورق بطلاء بلاتيني ذهبي لمدة 3 دقائق للحصول على طلاء 15 نانومتر. صور العينات باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح.

بعد ذلك ، استخدم مقياس الطيف الضوئي لجمع ملامح الامتصاص للحبيبات غير المتفاعلة والحبيبات المستخرجة والصبغة المستخرجة. خذ قياسا فارغا لعينات الحبيبات عن طريق إضافة 1 مل من الماء منزوع الأيونات إلى كوفيت نظيف. تخلص من الفراغ في حاوية نفايات.

بعد ذلك ، أضف المعلق الذي يحتوي على حبيبات الصباغ غير المتفاعلة إلى الكوفيت. اجمع أطياف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية لعينة الحبيبات. خذ قياسا فارغا ثانيا للصبغة المستخرجة باستخدام 1 مل من الميثانول الحمضي وكفيت نظيف.

أخيرا ، خذ طيف الأشعة فوق البنفسجية مقابل الطيف الماص للصبغة ثم حدد الحد الأقصى للطول الموجي لكل عينة. كشف الفحص المجهري الإلكتروني الماسح أن عملية استخراج الصباغ تقلل من متوسط قطر الحبيبات. قبل الاستخراج ، يبلغ متوسط قطر الحبيبات 527.3 نانومتر.

بعد إجراء الميثانول الحمضي ، ينخفض هذا الحجم بشكل كبير إلى حوالي 202.6 نانومتر. انخفاض يعتقد أنه ناتج عن استخراج الصبغة. عند إضافة الميثانول الحمضي ، يتناقص اللون المرتبط بالحبيبات غير المتفاعلة بشكل واضح.

تم الحصول على تأكيد هذه الفرضية باستخدام قياس الطيف الضوئي. يوضح هذا الرسم البياني ملف امتصاص واسع للحبيبات المستخرجة مسبقا وملف تعريف واسع بالمثل ولكن أقل كثافة للحبيبات المستخرجة بعد الاستخراج. في المقابل ، تظهر الصبغة المستخرجة القابلة للذوبان لامدا كحد أقصى عند حوالي 500 نانومتر وكتف مميز عند حوالي 380 نانومتر.

بشكل جماعي ، تشير هذه البيانات إلى الاستخراج الناجح للون المرئي من الحبيبات. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في حوالي أربع ساعات من البداية إلى النهاية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إزالة الأنسجة بالكامل التي تحتوي على الصفائح الدموية البروتينية العاكسة التي قد تتداخل مع الاستخراج والتحليل.

قد تتداخل أنسجة البشرة أيضا مع خطوات التجانس واستخراج الصبغة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى مثل كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة وقياس الطيف الكتلي لزيادة تنقية الأصباغ وتوصيف تكوينها. يمكن أن تساعد هذه الخطوات في توضيح المساهمات الجزيئية في التلوين في رأسيات الأرجل.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية لعلماء الأحياء البحرية والكيميائيين والمهندسين بما في ذلك: ما هو تكوين الأصباغ المستخدمة أثناء تغير اللون؟ وكيف تساهم في وظيفة وهيكل حبيبات النانو المبنية داخل أعضاء الكروماتوفور الجلدية؟ بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخراج الصبغة من الحبار الطازج ، doryteuthis pealeii chromatophores.