تصور آثار البلغم للتنمية بيوفيلم باستخدام نموذج غرف ساترة
ديسمبر 14, 2016
يصف هذا البروتوكول تصور تطور الأغشية الحيوية بعد التعرض لعوامل المضيف باستخدام نموذج غرفة الشريحة. يسمح هذا النموذج بالتصور المباشر لتطوير الأغشية الحيوية بالإضافة إلى تحليل معلمات الأغشية الحيوية باستخدام برامج الكمبيوتر.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور وقياس التغييرات في الأغشية الحيوية استجابة للبلغم والمضادات الحيوية. يمكن للباحثين استخدام هذه الطريقة لفهم الأسئلة الرئيسية ، مثل كيف يمكن أن تتأثر فعالية المضادات الحيوية المختلفة ضد الأغشية الحيوية البكتيرية بوجود البلغم. الميزة الرئيسية لهذه المنهجية هي أنها تسمح للأفراد برؤية التغييرات التي تحدث في الأغشية الحيوية استجابة لعوامل مختلفة.
لبدء التجربة ، سجل حجم عينة البلغم التي تم الحصول عليها مسبقا. أضف محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، أو PBS ، أضف ضعف حجم العينة. بعد ذلك، استخدم ماصة نقل لخلط العينة جيدا.
قمبتدوير العينة على أعلى إعداد لمدة دقيقة واحدة لخلطها تماما. Aliquot ملليلتر واحد من الخليط في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل. ثم قم بتدوير الأنابيب.
بعد الطرد المركزي ، احفظ المادة الطافية وتخلص من الحبيبات. قم بتعقيم المادة الطافية من خلال مرشح 0.22 ميكرون وجمعها في أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف. قم بتخزين المادة الطافية للبلغم على حرارة 80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
ضع 40 ميكرولترا من المزرعة المعدة مسبقا في أربعة ملليلتر من مرق لوريا الطازج ، أو وسائط LB ، وقم بزراعة البكتيريا للحصول على ثقافة بكثافة بصرية تبلغ 0.55 عند 600 نانومتر. بعد ذلك ، قم بتخفيف 100 ميكرولتر من ثقافة 0.5 OD إلى 400 ميكرولتر من مرشحات البلغم المحضرة بنسبة 10٪ بالرطل. استخدم 200 ميكرولتر من التخفيف لزرع آبار غرف الانزلاق. اسمح للبكتيريا بالالتصاق لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية دون اهتزاز.
بعد أربع ساعات ، قم بإزالة الوسائط وغسل الأغشية الحيوية برفق باستخدام 1X LB الطازج. استبدل الوسائط المتبقية ب 200 ميكرولتر من LB الطازج. اسمح للأغشية الحيوية بالنمو عند 37 درجة مئوية دون اهتزاز. استبدل الوسائط كل 12 ساعة دون غسل حتى يصبح الأغشية الحيوية جاهزة للفحص المجهري. من المهم جدا غسل الشرائح برفق حتى لا تعطل أي بكتيريا متصلة.
بعد النمو ، قم بإزالة الوسائط من آبار الغرفة وغسل كل غرفة برفق مرتين باستخدام 300 ميكرولتر من PBS المعقم. بعد ذلك ، لتحضير خليط تلطيخ الأغشية الحيوية ، أضف ميكرولتر واحد من كل صبغة متوفرة في مجموعة الجدوى إلى كل مليلتر من المحلول المطلوب واخلط المحلول. يتم تحديد المقدار الأمثل للصبغة ووقت التلوين تجريبيا لكل كائن حي.
أضف 200 ميكرولتر من خليط التلوين إلى كل بئر من زجاج الغطاء الحجري. احتضان زجاج الغطاء. بعد الحضانة ، قم بإزالة خليط التلوين من الغرف وغسل كل بئر ب 300 ميكرولتر من PBS المعقم.
استبدل PBS بوسائط جديدة. أخيرا ، تابع التصور عبر الفحص المجهري متحد البؤر. تظهر الصور التمثيلية لمركب Burkholderia cepacia ، أو العزلات السريرية BCC ، بعد 48 ساعة من النمو في زجاج الغطاء الحجري مع الوسائط وحدها أو في وجود 10٪ من مرشحات البلغم أن وجودها يمكن أن يغير بنية الأغشية الحيوية.
تم تحليل الصور باستخدام برنامج Comstat للحصول على معلمات الأغشية الحيوية الرئيسية ، بما في ذلك متوسط سمك الأغشية الحيوية ، والذي زاد عند معالجته بالبلغم بنسبة 10٪. من أجل تقدير تأثيرات العوامل المختلفة على نمو الأغشية الحيوية ، نمت العزلات السريرية في الوسائط فقط أو مع البلغم وتم علاجها إما بالمضادات الحيوية أو بدونها. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تكوين ومعالجة الأغشية الحيوية على زجاج الغطاء الحجري وإعدادها للتلوين والتحليل متحد البؤر.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول طريقة تصوير وقياس تطور الغشاء الحيوي (biofilm) استجابةً للبلغم والمضادات الحيوية باستخدام نموذج غرفة الشرائح. يسهل هذا النموذج الملاحظة المباشرة لتغيرات الغشاء الحيوي ويسمح بإجراء تحليل مفصل باستخدام برامج الحاسوب.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأحياء الدقيقة
- أبحاث الغشاء الحيوي
- فعالية المضادات الحيوية
خلفية علمية
- تعتبر الأغشية الحيوية مجتمعات معقدة من الكائنات الحية الدقيقة.
- يعد فهم استجابة الأغشية الحيوية للمضادات الحيوية أمراً بالغ الأهمية لاستراتيجيات العلاج.
- يمكن أن يؤثر البلغم على فعالية المضادات الحيوية ضد الأغشية الحيوية.
- تهدف هذه الدراسة إلى تصور هذه التفاعلات بشكل فعال.
الغرض من الدراسة
- لتصور التغيرات في الغشاء الحيوي (biofilms) الناتجة عن التعرض للبلغم والمضادات الحيوية.
- لتقدير تأثير عوامل المضيف على تطور الغشاء الحيوي.
- لتعزيز فهم فعالية المضادات الحيوية ضد الأغشية الحيوية.
الطرق المستخدمة
- جمع عينات البلغم.
- تخفيف البلغم باستخدام المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS).
- خلط العينات لضمان التجانس.
- تصوير تطور الغشاء الحيوي (Biofilm) باستخدام نموذج غرفة الشرائح.
النتائج الرئيسية
- التصور المباشر لتغيرات الغشاء الحيوي استجابةً للمضادات الحيوية.
- التحليل الكمي لمعايير الغشاء الحيوي.
- رؤى حول التفاعل بين البلغم واستجابة الغشاء الحيوي.
- إثبات فعالية مختلف المضادات الحيوية.
الاستنتاجات
- يعتبر نموذج غرفة الشريحة فعالاً لدراسة ديناميكيات الغشاء الحيوي.
- تؤثر عوامل المضيف، مثل البلغم، بشكل كبير على سلوك الغشاء الحيوي.
- يمكن لهذه المنهجية أن تساهم في توجيه استراتيجيات علاج المضادات الحيوية المستقبلية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يعالج التصوير الكمي لتطور الغشاء الحيوي (biofilm) في وجود البلغم المشتق من المضيف والمضادات الحيوية تحديًا حاسمًا في اكتشاف مضادات العدوى ودقة النماذج الترجمية. يتيح هذا النهج تقليل المخاطر الآلية من خلال الكشف عن كيفية تأثير عوامل المضيف على فعالية المضادات الحيوية وبنية الغشاء الحيوي، مما يوجه استراتيجيات التحقق من الأهداف وعمليات الفحص في المراحل المبكرة. وتدعم هذه الطريقة الثقة التنبؤية لاتخاذ قرارات المحفظة البحثية في مجال البحث والتطوير الخاص بالأمراض المعدية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من صحة الهدف
- يتيح استقصاء الفرضيات العلاجية المتعلقة بتأثير عوامل المضيف على مرونة الغشاء الحيوي (biofilm).
- يدعم الحد من المخاطر البيولوجية من خلال قياس استجابة الغشاء الحيوي للمضادات الحيوية في مصفوفات ذات صلة بالمرض.
- يسهل التحقق من صحة الأهداف الوظيفية عن طريق قياس حيوية الغشاء الحيوي وبنيته تحت ظروف محددة.
الفحص وتطوير المقايسة
- تحضير أنظمة غشاء حيوي (biofilm) معتمدة لفحص المركبات لاحقاً في ظل وجود عوامل ذات صلة سريرياً.
- توحيد ظروف المقايسة لضمان قابلية التكرار والمقارنة الكمية بين المجموعات التجريبية.
- إنتاج مخرجات كمية قوية، مثل سمك الغشاء الحيوي ومدى الحيوية، لتقييم دقيق للمركبات.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- يوائم نماذج الغشاء الحيوي (biofilm) المختبرية مع البيئات المضيفة ذات الصلة بالمرض، مما يعزز الاستمرارية الانتقالية.
- يدعم التقدم القائم على تعديل المخاطر من خلال الكشف عن أداء المضادات الحيوية في المصفوفات البيولوجية المعقدة.
- يوفر رؤية ميكانيكية للتفاعلات بين المضيف والممرض والدواء من أجل تقليل المخاطر التنبؤية.
تكامل مسار العمل والتدفق الإجرائي
يتكامل نموذج غطاء الشريحة ذو الغرف هذا ضمن التسلسل الممتد من مرحلة الاكتشاف إلى المرحلة قبل السريرية، وذلك من خلال تمكين الاختبار القائم على الفرضيات لفعالية المضادات الحيوية في أنظمة الغشاء الحيوي المحاكية للعائل.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بتأثير عوامل المضيف وتوضيح المسارات في تطور الغشاء الحيوي.
- الفحص: توفر قراءات كمية وقابلة للتكرار لتحديد أولويات المركبات في سياقات الغشاء الحيوي.
- التحليلات: توفر قياسات قائمة على الصور ومخرجات إحصائية للمقارنة بين الظروف المختلفة.
- الأبحاث traslational: تربط النتائج المخبرية (in vitro) بالنماذج قبل السريرية من خلال دمج المصفوفات ذات الصلة بالمرض.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: توفر منصة موحدة وقابلة للتكيف للتقييم المتكرر لاستراتيجيات مكافحة الغشاء الحيوي.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: زيادة الثقة التنبؤية وتقليل الغموض الميكانيكي في عمليات البحث والتطوير لمضادات العدوى.
- القيمة التشغيلية: تعزيز التوحيد القياسي وقابلية التكرار وقابلية التوسع في فحوصات الغشاء الحيوي.
- القيمة الاستراتيجية: تحسين قرارات المضي قدماً أو التوقف وكفاءة رأس المال من خلال الكشف عن فعالية الدواء المعتمدة على السياق.
- تأثير المحفظة: تمكين تحديد الأولويات للمرشحين بناءً على المخاطر المعدلة وفقاً للأداء في الأنظمة المحاكية للمضيف.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في زراعة الغشاء الحيوي (biofilm)، والمجهر البؤري (confocal microscopy)، والتحليل الكمي للصور.
- يستلزم الوصول إلى أنظمة الغطاء الزجاجي ذات الغرف، وأطقم صبغ الحيوية، وبرامج تحليلية مثل Comstat.
- يتطلب توحيداً قياسياً بين الفرق في بروتوكولات تحضير العينات والتصوير.
- قد يتطلب تكييفاً ليتناسب مع أنواع مختلفة من البكتيريا أو المصفوفات المشتقة من المضيف.
- يعتمد على التحسين التجريبي لمعايير الصبغ والتصوير لكل كائن حي.
