تصور الأنسجة البين الستيرويدي المنشأ ولها المكروية الأوعية الدموية في الزرد

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن الخلايا الستيرويدية بين الكلى المتمايزة في أسماك الزرد النامية من خلال مقايسة نشاط إنزيمي بسيط كامل. يمكن أن يساعد إجراء التلوين هذا في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بالآليات الجزيئية والخلوية لتكوين الغدة الداخلية الكلوية والتشوهات. الميزة الرئيسية لاختبار التلوين هذا هي أنه سريع وبسيط وموثوق به ، مما يجعله أداة قوية للشاشات الجينية أو الكيميائية في أسماك الزرد.

يمكن إجراء هذا الإجراء على خطوط مراسل الفلورسنت الترانيجيني ، مع تمييز الكلى والأوعية الدموية بحيث يمكن تحليل أنسجة متعددة في نفس الجنين. بالاقتران مع التقسيم الاهتزازي والكيمياء المناعية والفحص المجهري متحد البؤر ، يمكن أيضا تصور البيئة المكروية الوعائية للأنسجة بين الكلى. بعد تحضير محاليل المخزون لثلاثة تلطيخ نشاط بيتا Hsd وفقا لبروتوكول النص ، ضع أجنة الزرد النامية في 0.03٪ PTU في ماء البيض لمنع تكوين الصبغة.

إصلاح الأجنة منزوعة الاشتباك ، أو اليرقات ، في 2٪ أو 4٪ PFA في PBS مع 0.1٪ Tween 20 ، أو PFAT. باستخدام PBST ، اغسل الأجنة أربع مرات لمدة 10 دقائق لكل منها ، مع التأكد من عدم جفاف العينات بين الغسل. قبل تفاعلات التلوين ، قم بإعداد الأجزاء A و B حديثا في أنابيب منفصلة ، ثم قم بدوامة الطرد المركزي المحاليل.

من الضروري تحضير الجزأين A و B في أنابيب منفصلة. ستؤدي إضافة جميع المكونات مباشرة إلى أنبوب واحد إلى هطول أمطار شديدة على الفور. أضف الأنبوب الكامل للجزء A إلى الأنبوب بأكمله للجزء B.Mix جيدا ، ووزع على الفور ملليلترا واحدا في كل أنبوب ميكرو يحتوي على أجنة ثابتة ومغسولة.

استخدم رقائق الألومنيوم لتغليف الأنابيب ، وضعها في درجة حرارة الغرفة على دوار أو منصة هزاز مع اهتزاز لطيف. حدد وقت التفاعل تجريبيا باستخدام المجهر لمراقبة الإشارات الملونة. سوف تتطور هطول الأمطار الطفيفة بمرور الوقت والتي لن تتداخل مع عملية التفاعل.

أوقف التفاعل باستخدام PBST لغسل الأجنة أربع مرات لمدة 10 دقائق لكل منها ، ثم قم بإصلاح الأجنة الملطخة بنسبة 4٪ PFAT في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة. للفحص المجهري الكامل ، استخدم 50٪ من الجلسرين في PBS لتنظيف الأجنة. بعد ذلك ، بعد توجيهها بحيث يكون الجانب الظهري متجها لأعلى ، راقب العينات باستخدام مجهر عمودي تحت إضاءة المجال الساطع.

قم بإزالة صفار الجنين واستخدامه لإعداد حامل مسطح. بعد ذلك ، التقط صورة عالية الدقة لمورفولوجيا الأنسجة بين الكلى. لتحليل البيئة المكروية للأوعية الدموية للأنسجة الستيرويدية ، قم بإصلاح الأجنة الملطخة بعد 2٪ PFA.

استكمله ب 1٪ Triton X-100 عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة ، واستخدم PBST-X لغسل الأجنة في درجة حرارة الغرفة أربع مرات لمدة 10 دقائق لكل منها. لتضمين الأجنة ، قم بإعداد 4٪ من الاغاروز منخفض الذوبان عن طريق إذابة الاغاروز في PBS عند 95 درجة مئوية. ثم ، قم بتخزينها في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، وتخزينها عند أربع إلى ثماني درجات مئوية.

قم بإذابة 4٪ من الاغاروز منخفض الذوبان عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم احتفظ بكمية 47 درجة مئوية. باستخدام غطاء منفصل من أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5٪ مليلتر كقالب ، قم بتضمين جنين في الاغاروز المنصهر ، واتركه ليبرد حتى يصبح صلبا. لإجراء تقسيم الاهتزاز ، قم بلصق قطعة من الشريط الورقي على المنصة الجافة للاهتزاز.

ثم استخدم شفرة حلاقة لإزالة كتلة الاغاروز المتصلبة من القالب. ضع الغراء الفائق على الشريط الورقي على المنصة ، وقم بتثبيت كتلة الاغاروز على الشريط الورقي بحيث يكون الجانب الأمامي من العينة متجها لأعلى. بعد ذلك ، قم بقص كتلة الاغاروز إلى شكل منشور شبه منحرف بحوالي أربعة إلى ثمانية ملليمترات على كل جانب من الجوانب العلوية والسفلية على التوالي.

استخدم قطارة مملوءة ب PBS البارد مع 0.5٪ Trident X-100 لشطف كتلة الاغاروز. ثم استخدم اهتزاز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لإعداد أقسام 100 ميكرومتر. باستخدام إبرة قياس 26 ، قم بإزالة الأجزاء المقطوعة من الاهتزاز وانقلها إلى صفيحة موضعية تحتوي على 500 ميكرولتر من البرد 0.5٪ PBST-X لكل بئر.

اجمع أقسام الأنسجة الإيجابية الثلاثة لنشاط beta-Hsd عن طريق فحصها تحت مجهر التشريح ، واستخدم طرف ماصة لنقل الأقسام إلى صفيحة مكونة من 96 بئرا تحتوي على 0.5٪ PBST-X بارد. مزيد من وصمة لقطة وتصوير الأقسام وفقا لبروتوكول النص. لتحديد كيفية تطور الأنسجة الكلوية الداخلية الستيرويدوجينية مع كبيبات الكلى الكيدة والأوعية الدموية الوليدة ، تم إجراء اختبار النشاط الأنزيمي الثلاثة beta-Hsd على جنين أسماك الزرد المزدوج المعدلة وراثيا ، معبرا عن كل من التألق الخاص بالكلى والبطانة.

كما هو موضح هنا ، توجد ثلاثة أنسجة ستيرويدوجينيك إيجابية بيتا Hsd على يمين خط الوسط وتدلل على الفور كبيبات الكلى الكوي. تبدأ بعض الخلايا الستيرويدوجينيك أيضا في الهجرة عبر خط الوسط. تم تحليل أقسام الاهتزاز هذه من الأجنة المعدلة وراثيا التي تعبر عن GFP البطاني الخاضع لمقايسة beta-Hsd الثلاثة بواسطة الكيمياء المناعية للكشف عن الفيبرونيكتين ومستجيبه النهائي ، كيناز الالتصاق البؤري الفسفري.

يعتبر ترسب الشريان الأورطي حول الظهر للفيبرونيكتين ضروريا لدعم نمو الأوعية الدموية بين الكلى. بالنسبة لجنين السمك أو اليرقة ، يمكن إجراء التلوين الكيميائي النسيجي الكامل في غضون يوم واحد إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. على الرغم من أن طريقة التلوين هذه بسيطة وسريعة ، فمن المهم أن تتذكر أنها تكتشف إنزيما واحدا فقط من المسار الستيرويدي.

إذا كان الهدف من إجراء تحليل تنموي للأنسجة بين الكلى ، بالإضافة إلى هذا الفحص ، فسيتعين إجراء السكن في الموقع للكشف عن التعبير عن الجينات الهامة الأخرى المشاركة في تكوين الستيرويدات.