ومنصة للفحوصات مكافحة بيوفيلم مناسبة لاستكشاف المكتبات مركب طبيعي

العام من منصة الفحص هذه هو توفير تدفق عمل فحص هادف يجمع بين ثلاث نقاط نهاية ذات صلة وقابلية للحياة والكتلة الحيوية ومصفوفة الأغشية الحيوية ، لتحديد وتوصيف المركبات الجديدة المضادة للأغشية الحيوية. يمكن أن تساعد هذه المنصة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال اكتشاف عوامل الأغشية الحيوية ، من خلال السماح بالتمييز المبكر بين تأثيرات العلاج الكيميائي قصيرة المدى مقابل طويلة المدى بطريقة متوافقة سريعة وموضحة. الميزة الرئيسية لهذه المنصة المطورة هي أنها تجمع بين فحوصات مختلفة لتوفير صورة أكثر اكتمالا للتأثيرات المضادة للأغشية الحيوية للمكتبات الكيميائية ، وخاصة المركبات الطبيعية.

لبدء التجربة ، قم بإعداد عينات ضابطة غير معالجة ب 200 ميكرولتر من 10 إلى سادس CFU لكل مليلتر مزرعة بكتيرية لكل بئر من لوحة معقمة 96 ميكروويل. قم بتضمين عناصر التحكم في الوسائط بدون مزرعة بكتيرية. بعد ذلك ، على نفس ألواح البئر البالغ عددها 96 لوحة ، قم بإعداد عينات بأربعة ميكرولترات من محلول مخزون المضادات الحيوية 50x و 196 ميكرولترا من زراعة البكتيريا لكل بئر ، ثم احتضان الثقافات.

استمر في تلطيخ الريزازورين باستخدام ماصة متعددة القنوات لنقل محلول العوالق بالكامل، بعناية، دون لمس الأغشية الحيوية أو تكوين فقاعات هواء، إلى صفيحة منفصلة ونظيفة سعة 96 بئر. مرة أخرى ، باستخدام ماصة متعددة القنوات ، اغسل الأغشية الحيوية ، مرة واحدة ، باستخدام PBS معقم عن طريق إضافة 200 ميكرولتر لكل بئر وإزالة المحلول بعناية. أضف 200 ميكرولتر من محلول 20 ميكرومولار ريزازورين ، لكل بئر ، من لوحة الأغشية الحيوية واحتضان الأغشية الحيوية ، في الظلام ، عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة ، حتى تصبح عناصر التحكم في الأغشية الحيوية غير المعالجة وردية بشكل متساو.

ثم قم بقياس التألق باستخدام قارئ لوحة. قم بإزالة بقعة الريزازورين بعناية من الآبار. قم بإصلاح الأغشية الحيوية ب 200 ميكرولتر من الميثانول لمدة 15 دقيقة.

بعد التثبيت ، قم بإزالة الميثانول واترك اللوحة تجف في الهواء لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 190 ميكرولتر من محلول بنفسجي بلوري بنسبة 0.02٪ بعناية إلى الأغشية الحيوية. تجنب لمس جوانب الآبار ، مع البقعة ، أثناء سحب العينات ، ومنع تكون فقاعات الهواء ، ولا تضغط على الماصة لإكمال الانفجار.

ثم احتضن الطبق لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بإزالة البقعة بعناية. اغسل الأغشية الحيوية ب 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات.

اترك الآبار تجف لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإذابة البقعة المتبقية في 33٪ حمض الأسيتيك. احتضن الطبق لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، اقرأ الامتصاص عند 595 نانومتر.

قم بقياس التعكر عند 595 نانومتر من لوحة محلول العوالق المحضرة. يمكن القيام بذلك أثناء حضانة الصفيحة الملونة باللون البنفسجي الكريستالي. بعد ذلك ، قم بتلطيخ بكتيريا العوالق ، باستخدام الريزازورين ، عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من مخزون الريزازورين لكل بئر.

ماصة المحلول لخلطه جيدا. احتضن اللوحة ، في الظلام ، في درجة حرارة الغرفة ، 200 دورة في الدقيقة ، لمدة خمس دقائق تقريبا ، حتى تصبح عناصر التحكم غير المعالجة وردية بشكل متساو. ثم قم بقياس التألق.

احصل على إحدى لوحات العينات المتوازية لهذا التلوين، واستخدم ماصة متعددة القنوات لإزالة محلول العوالق من الآبار. اغسل الآبار ، مرة واحدة ، باستخدام PBS المعقم بعناية ، دون لمس الأغشية الحيوية. أضف 200 ميكرولتر من agglutinin جنين القمح ، أو محلول WGA ، لكل بئر ، ليتم تلطيخه.

ثم احتضن اللوحة. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا باستخدام PBS ، ثلاث مرات ، لإزالة البقعة غير المرتبطة. دع الطبق يجف لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

تصور العينات باستخدام مجهر مضان ومرشح FITC. قم بإذابة البقعة المرتبطة في 200 ميكرولتر من 33٪ حمض الخليك لكل بئر. أغلق الآبار بأغطية شريطية وقم بصوتها باستخدام جهاز صوتي حمام مائي.

بعد الصوتنة ، احتضان اللوحة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. بعد ساعة واحدة ، كرر الصوتنة مع الحفاظ على الآبار مغلقة بين خطوات الصوتنة. قم بقياس التألق باستخدام قارئ لوحة.

مرة أخرى ، خذ إحدى لوحات العينات المتوازية لهذا التلوين ، وباستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بإزالة محلول العوالق من الآبار. ثم اغسل الآبار مرة واحدة باستخدام PBS معقم. أضف ستة ميكرولترات من محلول التلوين لكل بئر ، واحتضن اللوحة في الظلام لمدة 15 دقيقة.

قبل الفحص المجهري، قم بإزالة السائل الزائد يدويا باستخدام ماصة متعددة القنوات. التقط الصور باستخدام مجهر مضان مع مرشح FITC ، للتألق الأخضر ، لتصور الخلايا القابلة للحياة ومرشح TRITC ، للتألق الأحمر ، لتصور الخلايا الميتة. استخدم إحدى ألواح العينات المتوازية لهذا التلوين ، وقم بإزالة محلول العوالق من الآبار ، واغسل الآبار مرة واحدة باستخدام PBS معقم ، باستخدام ماصة متعددة القنوات.

بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من محلول التلوين ، لكل بئر ، واحتضنها لمدة 15 دقيقة في الظلام. أخيرا ، قم بقياس التألق باستخدام قارئ لوحة. تم إجراء عرضين لإثبات أداء المنصة كنسبة مئوية من التحكم في الأغشية الحيوية غير المعالجة.

حدد فحص مكتبة مشتق قلويد الكينا مركبا نشطا واحدا. حدد فحص مكتبة من ثنائيات التربينويدات ومشتقاتها من نوع الأبيتان خمسة مركبات نشطة. يقلل كل من البنسلين G و Ciprofloxacin بشكل كبير من قابلية البقاء والكتلة الحيوية ومحتوى PNAG لمصفوفة الأغشية الحيوية قبل تكوين الأغشية الحيوية.

ومع ذلك ، لم يكن هذا هو الحال عند استخدام ما بعد التعرض. كانت النتيجة الأبرز هي زيادة مصفوفة الأغشية الحيوية إلى أكثر من 200٪ عندما تم معالجة الأغشية الحيوية مسبقة التشكيل بتركيزات عالية من البنسلين G.تؤكد هذه الصورة الفلورية أن البنسلين G يقتل حوالي 50٪ من المكورات العنقودية الذهبية والأغشية الحيوية والسكان البكتيريين. يشير متوسط نسب التألق الأخضر إلى الأحمر لآبار الأغشية الحيوية غير المعالجة إلى غلبة الخلايا الحية.

بينما تحتوي الآبار المعالجة بالبنسلين على حوالي 56٪ من الخلايا الحية. أنتجت الخلايا التي بقيت على قيد الحياة ، بعد علاج البنسلين ، كمية أعلى بكثير من المواد البوليمرية خارج الخلية ، أو EPS ، عند مقارنتها بالأغشية الحيوية غير المعالجة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الانتباه إلى المناولة اليدوية للماصة لتجنب تلوث البكتيريا والبقع بين الآبار.

باتباع هذه المنصة ، يمكن تحديد وخصائص مركبات مضادات الأغشية الحيوية الفعالة ضد المكورات العنقودية الذهبية بسرعة. إذا تم استخدام أنواع بكتيرية أخرى ، فستكون هناك حاجة إلى تحسين آخر لبروتوكولات التلوين ، لكن منطق النظام الأساسي سيظل كما هو.