إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي، اختبار مزدوج قراءات من بين الخلايا مضادات الميكروبات آخر وحقيقية النواة السمية لخلايا

الهدف العام من هذا البروتوكول هو استخدام مجموعة واحدة من الاختبار في الوقت الفعلي لتحديد مثبطات جزيئات صغيرة محددة لنمو البكتيريا داخل الخلايا غير سامة للخلايا المضيفة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال اكتشاف مضادات الميكروبات. على وجه التحديد ، ما هي أنواع المركبات التي يمكن أن تخترق المقصورات داخل الخلايا وتقتل مسببات الأمراض دون الإضرار بالخلية المضيفة؟

المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي نمو البكتيريا ، يتم الكشف عن سمية خلايا الثدييات في وقت واحد باستخدام فحوصات غير مدمرة في الوقت الفعلي. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة مع قابلية التوسع التي توفرها يتطلب فحص أكثر من عشرة آلاف مركب في الجلسة مجموعة جديدة كاملة من التقنيات والمعدات.

بالإضافة إلى لوسيوس ، يظهر التزاما مجتمعيا بالاكتشاف الأكاديمي لمضادات الميكروبات وعلم الأحياء الدقيقة التشخيصي الانتقالي زملاء ما بعد الدكتوراه ، KP Smith ، و Yoon-Suk Kang ، و Jennifer Tsang ، و Thea Brennan-Krohn ، والجامعية كات ترولسون. لتحضير الخلايا المضيفة ، استزراع J774A. 1 البلاعم معلقة في RPMI 1640 ، مع تسعة بالمائة من مصل العجل المكمل بالحديد.

في البداية مرور الخلايا في قوارير زراعة الأنسجة. بعد أن تتجمع الخلايا في قارورة زراعة الأنسجة التي تبلغ مساحتها 75 سم مربع في 15 مل من الوسط ، قم بتقسيم الخلايا عن طريق كشطها وتخفيفها إلى 65 مل بنفس النوع من الوسط. أعد 15 مل إلى قارورة زراعة الأنسجة ، وانقل 50 مل إلى قارورة شاكر بكتيرية سعة 250 مل.

قم بالتهوية عن طريق ضبط سرعة الدوران عند 120 دورة في الدقيقة تقريبا. للحصول على نمو ثابت ، احتضن بنسبة خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية بالضبط. حصاد الخلايا عندما تصل إلى كثافة في حدود اثنين وخمسة ملايين خلية لكل مليلتر ، إلى خمسة ملايين خلية لكل مليلتر.

تأكد من أن نسبة الخلايا الميتة لا تتجاوز 25 بالمائة ، لأن الخلايا الميتة ستزيد من ضوضاء الخلفية في فحوصات السمية الخلوية. من الأهمية بمكان منع استقرار الخلايا في الخزانات عند توزيع كميات كبيرة من البلاعم والبكتيريا باستخدام معالجات السوائل. قم بتدوير الخزانات كل بضع دقائق أثناء الاستغناء لتجنب عدم التوحيد وآبار لوحة الفحص.

قم بلوحة الخلايا في زراعة الأنسجة البيضاء المعالجة ، 384 صفيحة دقيقة جيدا عند 50 ، 000 خلية في 30 ميكرولتر من وسط زراعة الأنسجة لكل بئر. احتضن الصفائح الدقيقة بين عشية وضحاها لتحقيق التقاء تسعين بالمائة في يوم التجربة. قم بإعداد بقع من البكتيريا للتجارب ، عن طريق نشر الكائنات الحية بكثافة على صفيحة BCYE جديدة واحتضانها يوما ما للحصول على نمو ملتق.

أعد تعليق الكائنات الحية في نفس وسط زراعة الأنسجة المستخدم في خلايا J774A. 1. لإجراء عدوى البلاعم ، أضف مركبات الاختبار ذات الأهمية ، بما في ذلك مركبات الفحص ، والضوابط الإيجابية والسلبية لتثبيط نمو البكتيريا في تحلل الخلايا حقيقية النواة.

يجب إذابة محاليل المخزون بمعدل أكبر من أو يساوي 500 مرة في DMSO أو محلول مائي ، للسماح بتخفيف كاف للسيارة. تمييع البكتيريا المضيئة إلى هدف اثنين من نقاط الخمسة مليون CFU لكل مليليتر في وسط زراعة الأنسجة. بعد ذلك ، أضف صبغة العثور على الحمض النووي غير السام الغشائي غير السام عند تركيز الفحص النهائي بنقطتين خمسة ×.

أضف 20 ميكرولترا من هذا الخليط إلى كل ثقافة جيدا. حجم الفحص النهائي هو 50 ميكرولتر ويجب أن يكون التركيز البكتيري النهائي مليون وحدة تشكيل مستعمرة لكل مليلتر لمراسل لوكس إيبرون ، أو أربعة ملايين وحدة تشكيل مستعمرة لكل مليلتر لمراسل البروتين الفلوري. احتضن عند 37 درجة مئوية ، لمدة يوم إلى ثلاثة أيام في خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون عند رطوبة نسبية 100 في المائة لمنع تأثيرات حافة التبخر.

لتجنب تأثيرات الحافة المرتبطة بدرجة الحرارة عند قراءة نتائج الفحص ، قم بموازنة الصفائح الدقيقة حراريا قبل قراءة التلألؤ عن طريق وضعها في طبقة واحدة على مقعد المختبر مع الأغطية مفتوحة لمدة 20 دقيقة تقريبا. اقرأ نمو البكتيريا وسمية الخلايا حقيقية النواة على مقياس الإضاءة الدقيقة ومقياس الطحين حسب ما يناسب المراسلين المستخدمين. أعد الألواح الدقيقة إلى الحاضنة إذا كانت القراءة في الوقت الفعلي مطلوبة في نقاط زمنية لاحقة.

تحليل البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص. لتجارب اختبار الاستجابة للجرعة والتآزر ، قم بإعداد البلاعم في البكتيريا كما كان من قبل. قبل عدوى البلاعم مباشرة ، أو الحضانة المحورية ، استخدم نظاما آليا لمعالجة السوائل لتسهيل استجابة جرعة واحدة في اختبار التآزر التوافقي الذي تم إعداده من خلال الإضافة الآلية المباشرة للتخفيفات المضادة للميكروبات وفقا لبروتوكول الشركات المصنعة.

أضف مضادات الميكروبات ذات الأهمية التجريبية في سلسلة تخفيف المضاعفة المتسلسلة. الهدف هو أن يمتد ، على النهاية العالية ، تركيزا يقضي تماما على النمو ، وفي النهاية المنخفضة ، تركيز لا يظهر أي نشاط واضح. تظهر هنا ، هي النتائج التمثيلية بمرور الوقت للتلألؤ البكتيري والتألق المرتبط بالسمية الخلوية.

لاحظ التأثيرات المتناقضة للعلاج المضاد للميكروبات والمنظفات السامة للخلايا حقيقية النواة. تم استخدام تحديد استجابة الجرعة المزدوجة IC50 و CC50 في نفس آبار الفحص لتحديد الانتقائية للمضاد الحيوي دوكسيسيكلين. تم تثبيط تكاثر البكتيريا بتركيزات وسيطة من المضادات الحيوية.

ومع ذلك ، لوحظت السمية الخلوية بتركيزات عالية تتفق مع انتقائية حوالي 100. تم استخدام نفس تنسيق الفحص لاختبار استجابة الجرعة ثنائية الأبعاد لتوليفات المينوسيكلين والأزيترومايسين. تربط Isocontours نقاط تثبيط النمو داخل الخلايا على قدم المساواة.

هنا ، اقترحت الخطوط المتساوية المقعرة تأثيرات تآزرية قوية للعقارين. أتاحت الروبوتات الاستغناء الرقمي لإعداد الفحص والقراءة في الوقت الفعلي والتنسيق عالي الإنتاجية اختبار التآزر الثلاثي الاندماجي. هنا ، تشير ملاحظة سطح مقعر بشكل واضح إلى درجة عالية من التأثير التآزري لمجموعات من المينوسيكلين والأزيترومايسين والريفامبين ضد النمو داخل الخلايا للفيلقية الفيوموفيلا.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الجمع بين قراءة مقايسة الفلورسنت أو الإنارة مع اختبار السمية الخلوية في الوقت الفعلي بتنسيق مقايسة عالي الإنتاجية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تطبيق طرق أخرى مثل المجهر متحد البؤر للإجابة على أسئلة حول الحدث البيولوجي في الخلية بأكملها ، والتي يتم تحديدها أيضا مع نشاطها المضاد للميكروبات أو السمية الخلوية للخلية بأكملها. على الرغم من أننا درسنا التأثيرات على تكاثر الفيلقية ، إلا أنه يمكن أيضا تطبيق نفس التقنيات على مسببات الأمراض الأخرى داخل الخلايا مثل البروسيلا والبكتيريا الدقيقة.

لقد تصورنا هذا البروتوكول لأول مرة عند محاولة اكتشاف اختبار بسيط وموثوق بما يكفي لاستخدامه في تنسيق فحص عالي الإنتاجية. لا تنس أن العمل مع مسببات الأمراض البكتيرية وخطوط الخلايا والمعدات الروبوتية ينطوي على بعض المخاطر الكامنة ويجب اتخاذ الاحتياطات المناسبة ، مثل استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.