المراقبة والقياس الكمي للسلوك التزاوج في غابة الصنوبر نيماتودا، Bursaphelenchus xylophilus

الهدف العام لهذا الإجراء هو مراقبة سلوك التزاوج للديدان الخيطية من خشب الصنوبر ، Bursaphelenchus xylophilus. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تطوير الدراسات النفسية للديدان الخيطية. يتعامل على وجه التحديد مع مراعاة سلوك التزاوج للديدان الخيطية من خشب الصنوبر.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن الحصول على البالغين البكر ، مما يجعل من السهل مراقبة سلوك التزاوج البالغين. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية فقط نحو الدراسة الأوسع للديدان الخيطية ، لأن لها سلوكيات دورات حياة مماثلة. لأن إثبات هذه الطريقة أمر بالغ الأهمية ، حيث أن اكتساب الديدان الخيطية البالغة البكر أمر صعب لأن قيود الديدان الخيطية التنموية تتطلب ممارسة وليس من السهل التمييز بدقة بين الذكور والإناث في المرحلة الأولى من الأحداث المبكرة.

لزراعة الديدان الخيطية من خشب الصنوبر ، قم أولا بإعداد أطباق أجار سكر العنب للبطاطس. لتلقيح لوحة ، قم بثقب قطعة من الحصيرة الفطرية بقطر 10 ملليمترات من حصيرة betritus senaria ، وضعها في منتصف لوحة المساعد الشخصي الشخصي الجديدة. استزراع الحصيرة الفطرية لمدة خمسة أيام عند 25 درجة مئوية في الظلام.

بعد خمسة أيام ، أضيفي الديدان الخيطية من خشب الصنوبر إلى طبق بتري المحضر وزرعهم لمدة ثلاثة أيام عند 25 درجة مئوية في الظلام. لعزل الديدان الخيطية عن الفطريات ، قم أولا بإعداد أداة تجميع. ضع أنبوبا مطاطيا مثبتا أسفل قمع ، وأمسك القمع المجهز في رف لتجميع جهاز قمع بيرمان.

ثم ضع طبقتين من ورق الترشيح بدلا من الشاش في فم القمع. الآن ، انقل الثقافات الفطرية إلى إعداد القمع وأضف الماء حتى تغمر الحصيرة الفطرية. بعد ساعتين ، ستخرج الديدان الخيطية من الثقافة الفطرية ، وتعبر ورق الترشيح ، وتستقر في الجزء السفلي من قمع بيرمان.

اجمع الديدان الخيطية عن طريق وضع أنبوب سعة 15 مليلتر أسفل القمع ، ثم حرر المشبك ببطء لجمع بضع قطرات من الماء ، والتي ستحتوي على الديدان الخيطية. قم بالطرد المركزي لمجموعات الديدان الخيطية عند 3 ، 000 جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بتخفيف المستوى العلوي من الماء ، وأعد تعليق الديدان في مليلتر واحد من الماء.

انقل تعليق الديدان الخيطية إلى طبق زجاجي يبلغ طوله ستة سنتيمترات ، وأضف ثلاثة ملليلتر من الماء لمساعدة الديدان الخيطية على السباحة بحرية. الآن ، اجمع البيض لصنع مخزون عذراء. انقل الطبق إلى حاضنة داكنة ، واترك الإناث الحوامل تضع البيض لمدة 10 دقائق.

بسبب سطح البروتين السكري ، سوف يلتصق البيض بالزجاج. بعد ذلك ، قم بإزالة الماء مع الديدان بعناية لتجنب إزعاج البيض الملتصق بالطبق. ثم أضف بسرعة 3 مل من الماء إلى الطبق لمنع البيض من الجفاف.

كرر عملية تنظيف البيض ثلاث مرات على الأقل ، لإزالة جميع اليرقات والبالغين والحصول على البيض النقي. إلى مجموعة البيض النقي المغسولة ، أضف خمسة ملليلتر من الماء ، واستمر في تطوير البيض في الظلام عند 25 درجة مئوية. بعد 24 ساعة من بدء زراعة البيض ، اجمع يرقات J2 المفرغة.

انقل يرقات J2 بعناية إلى أنبوب سعة 15 مل. ثم الطرد المركزي للمجموعة عند 3 ، 000 غرام لمدة دقيقتين. قم بتقطيع الطبقة العليا من الماء وأضف 200 ميكرولتر من الماء.

بعد ذلك ، قم بزراعة يرقات J2 على صفيحة المساعد الرقمي الشخصي المحضرة بحصيرة من الفطريات. بعد 52 ساعة ، ستتطور معظم يرقات J2 إلى يرقات J4 في المرحلة المبكرة. قم بتجميع قمع بيرمان ، واستخرج الديدان الخيطية من المزارع الفطرية لمدة ساعتين ، كما هو موضح سابقا.

أثناء الانتظار ، قم بإعداد إبرة لقطف الديدان. ارسم طرفا من شعيرات دموية زجاجية يتم تسخينها فوق موقد كحول. يجب أن يكون قطر الطرف حوالي 50 ميكرون ، أي ما يقرب من عرض جسم الديدان الخيطية البالغة.

بعد ساعتين ، انقل يرقات J4 إلى طبق بتري نظيف كما هو موضح سابقا. الآن ، مارس الجنس مع الديدان الخيطية تحت مجهر ستيريو. عادة ما يكون حوالي ثلثي اليرقات من الإناث.

من الواضح أن فرج الأنثى يختلف عن تشريح الذكور ، ولكن نظرا لأن الديدان نشطة للغاية ، فإن ممارسة الجنس سيتطلب ممارسة. الخطوة الأكثر أهمية لهذا البروتوكول هي التمييز بدقة بين الذكور والإناث في المرحلة الأولى المبكرة. خلاف ذلك ، سيكون هناك مختلط وسيء ، بمجرد أن يصبحوا بالغين.

وهذا يجعل من الصعب مراقبة التزاوج. تدريجيا ، قطف الديدان وانقلها إلى قطرة ماء على شريحة للذكور أو الإناث. لضمان النجاح ، يجب على شخصين مختلفين التحقق مرة أخرى من تخصيص الجنس.

الآن ، انقل قطرة الماء التي تحتوي على الديدان الجنسية إلى لوحة زراعة الفطريات المناسبة. بعد ذلك ، قم بتربية العذارى لمدة 24 ساعة أخرى قبل دراسة سلوك التزاوج. لمراقبة سلوك تزاوج الديدان الخيطية في خشب الصنوبر ، قم أولا بإعداد عدة شرائح مقعرة عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من الماء إلى كل بئر.

بعد ذلك ، اختر شخصا بالغا عذراء معدا ونقله إلى شريحة معدة. احتفظ بالبالغين البكر داخل البئر لمدة ساعة للسماح لهم بالتكيف مع البيئة المائية الجديدة. بعد ساعة ، أضف عذراء واحدة بالغة من الجنس الآخر إلى البئر باستخدام ماصة.

بعد ذلك ، لاحظ سلوك التزاوج تحت مجهر ستيريو ، وقم بتصوير السلوك للتحليل الكمي. عادة ما تنتهي عملية التزاوج بأكملها في غضون ساعتين. كل 30 دقيقة ، أضف 50 ميكرولتر من الماء للتعويض عن التبخر.

للتحقيق في اختيار التزاوج والمنافسة بين الجنسين ، قم بتجميع ومراقبة الديدان الخيطية البكر من مجموعتين مختلفتين. كان معدل نجاح التزاوج للبالغين البكر حوالي 87٪ وهو أعلى بكثير من معدل نجاح البالغين المختارين عشوائيا. استغرقت الأزواج في المتوسط 83 دقيقة لإكمال عملية التزاوج بأكملها ، والتي تحتوي على أربع مراحل مختلفة.

البحث والاتصال والازجاب والباقية. ضمن هذه المراحل ، يمكن ملاحظة العديد من أنماط السلوك المحددة. عندما التقت إحدى الإناث بعدة ذكور ، كان هناك خيار تزاوج واضح.

عادة ما تستخدم الأنثى رأسها للاتصال بذكر واحد ، عادة في الرأس والجسم والذيل والمنطقة التناسلية. ثم تزاوجت الأنثى مع الذكر ، أو تركته بسرعة ، وسبحت إلى ذكر آخر. تم قياس معدلات نجاح التزاوج بعد الاتصال الأول لمجموعات الديدان الخيطية المختلفة.

كما حدثت منافسة بين الجنسين. عندما اختلطت أنثى عذراء مع ثلاثة ذكور عذراء ، حاول الذكور الاقتراب من الأنثى والاتصال بها قدر الإمكان ، للحصول على فرصة التزاوج معها. عندما تم احتلال الفرج ، حاول الذكور الآخرون إزعاج عملية التزاوج باستخدام تقلبات الجسم العنيفة ، أو السحب لفصلهم.

كان ينظر إلى المنافسة بين الجنسين للإناث على أنها تشبه إلى حد ما المنافسة بين الجنسين بين الذكور. بسبب المنافسة بين الجنسين ، كانت ترددات الجماع مع المجموعات المختلفة مختلفة مختلفة اختلافا كبيرا. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق لاستكشاف البيئة السلوكية في الديدان الخيطية.

بمجرد إتقانه، يمكن إكمال هذا الإجراء في غضون 12 يوما، إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر فصل الذكور عن الإناث بدقة ، والأحداث في المراحل الأربع المبكرة للحصول على بالغين عذراء.