تقييم وظيفة الطاقة البيولوجية في خلايا دماغي الأوعية الدموية غشائي

تتمثل الأهداف العامة لهذا الإجراء في تقييم كيفية تأثير تغيرات وظائف الميتوكوندريا على تطور الاضطرابات العصبية وتصميم العلاجات التي لها تأثير مباشر على فتحات الحاجز الدموي الدماغي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الاضطرابات العصبية ، مثل كيف يمكن تقليل موت الخلايا العصبية بعد السكتة الدماغية؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر تقييما في الوقت الفعلي لوظيفة الميتوكوندريا في الخلايا السليمة بأكملها.

بعد زراعة الخلايا البطانية الوعائية الدماغية في وسط كامل ، في قارورة زراعة الأنسجة T75 سم مربع ، عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون إلى 80٪ التقاء ، تخلص من وسط زراعة الخلايا ، واشطف الخلايا باستخدام التربسين EDTA. ثم أضف ملليلترا إلى ملليلترين من التربسين الطازج EDTA إلى القارورة وافصل الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. بعد التأكد من رفع الخلايا تحت المجهر المقلوب ، أوقف التفاعل بإضافة لطيفة ل 10 مل من وسط الخلية الكاملة الطازجة وانقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر للطرد المركزي.

تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات في 10 مل من وسط النمو الكامل الطازج للحصول على طرد مركزي آخر. ثم أعد تعليق الحبيبات في وسط النمو الكامل عند اثنين في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل تركيز مليلتر للزراعة الفرعية. بعد العدد المناسب من المزارع الفرعية ، قم بالبذور 1.6 في 10 إلى الخلايا الرابعة في 80 ميكرولتر من الوسط الكامل لكل بئر ، على لوحة ثقافة خلايا التدفق خارج الخلية 96 بئرا ووضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

عندما تلتصق الخلايا باللوحة ، أضف المعالجة ذات الأهمية إلى الآبار المناسبة وأعد الخلايا إلى الحاضنة. في اليوم السابق لمقايسة التقييم الوظيفي للميتوكوندريا ، قم بترطيب خرطوشة رقيب التدفق خارج الخلية ب 150 ميكرولترا من محلول العيار خارج الخلية واحتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون. في صباح اليوم التالي ، استخدم محطة غسيل الألواح لتغيير وسط زراعة الخلية إلى وسط فحص التدفق خارج الخلية 7.0 درجة الحموضة.

ثم احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، بدون ثاني أكسيد الكربون ، لمدة 30 إلى 60 دقيقة. عندما تكون الخلايا متوازنة ، قم بتحميل الخرطوشة الرطبة في المحلل الحيوي وانقر فوق الزر "ابدأ" لبدء المعايرة. في نهاية المعايرة، انقر فوق موجه إلغاء قفل الخرطوشة لإزالة اللوحة السفلية للخرطوشة وتحميل لوحة الخلية.

ثم افتح ملف البيانات للحصول على قيم المعدل من المحلل الحيوي للتصدير إلى ملف جدول البيانات. بالنظر إلى أن الحركية والشدة النسبية للاستجابات تختلف بين أنواع الخلايا البطانية الوعائية الدماغية المختلفة ، في هذه التجارب ، سلسلة من تركيزات bEnd. تم استخدام 3 خلايا لتحديد العدد الأمثل للخلايا لقياس مستويات معدل استهلاك الأكسجين في مقايسة التنميط الأيضي.

كما لوحظ ، فإن التنفس القاعدي والأقصى والقدرة التنفسية الاحتياطية تظهر استجابة متناسبة لكثافة الخلايا. ومع ذلك ، ينخفض إنتاج ATP عند استخدام أعلى تركيز للخلايا لكل بئر ، مما يشير إلى أن ثقافة الخلايا الملتصقة ليست مناسبة للتجربة. مع ظهور كثافة الخلايا المثلى في النطاق المتوسط لأعداد الخلايا لكل بئر.

لذلك ، تم تقييم مستويات معدل استهلاك الأكسجين المتوقعة في هذه التجربة التمثيلية باستخدام تركيز خلية متوسطة المدى ، مما يدل على أن جزيئات mRNA السليفة غير المشفرة تقلل من وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا البطانية الوعائية الدماغية. توضح هذه التجارب أيضا أن أقصى تنفس وسعة احتياطية ينخفضان بشكل كبير من خلال الإفراط في التعبير عن هذه الجزيئات في الخلايا البطانية الوعائية الدماغية في غضون 24 ساعة بعد التعدي ، على الرغم من أن التنفس القاعدي وإنتاج ATP وتسرب البروتون لا تظهر أي تغييرات كبيرة. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون يومين.

من طلاء الخلايا إلى الوصول إلى وظيفة الميتوكوندريا ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تحديد كثافة الخلايا المثلى أمر مهم للغاية قبل البدء في أي إجراءات أخرى. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل قابلية الخلية للحياة أو فحوصات حال السكر ، للإجابة على أسئلة إضافية حول التغييرات التي تحدث في وظيفة الميتوكوندريا بسبب انخفاض صلاحية الخلية أو التغيرات في مسارات التمثيل الغذائي الأخرى.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال وظيفة الميتوكوندريا لاستخدام الخلايا السليمة داخل الميتوكوندريا المعزولة ومجموعة متنوعة من الأمراض ، بما في ذلك الأمراض العصبية أو السرطان أو اضطرابات التمثيل الغذائي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الوصول إلى وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا البطانية الوعائية الدماغية.