المعالجة سيفوبيرازون ماوس نموذج سريريا ذات صلة

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تقديم دليل خطوة بخطوة لتنفيذ نموذج الفأر المصاب بـ Clostridium difficile باستخدام السيفوبيرازون، مع تركيز خاص على مراقبة المرض سريرياً، وتعداد البكتيريا، وسمية الذيفانات الخلوية، والتغيرات الهيستوباثولوجية بعد التحدي. سيساعد هذا البروتوكول التفصيلي الباحثين على تنفيذ نموذج فأر للإصابة بـ Clostridium difficile بدقة، وهو أمر ضروري لدراسة إمراضية هذه البكتيريا وتقييم العلاجات الجديدة. وتتمثل الميزة الرئيسية لاستخدام نموذج الفأر هذا في أن التعرض لمضاد حيوي واحد لمدة خمسة أيام يجعل الفئران عرضة لاستعمار C.difficile ولمسار سريري مطول من العدوى يتزامن مع المرض البشري.

للبدء، خذ سلالة C.difficile المخزنة المطلوبة وقم بمعالجتها بجهاز المزج الدوامي (vortex). وفي غطاء تدفق صفائحي، خفف السلالة المخزنة في ماء معقم داخل أنبوب ذي غطاء لولبي لتصل إلى تركيز 10^5 بوغ لكل 25 ميكروليتر. ضع ملصقاً على المزيج باسم "لقاح البوغ" (spore inoculum)، ثم ضع الأنبوب في حمام مائي عند درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك، وباستخدام غطاء التدفق الصفائحي، انقُل 50 µL من لقاح الأبواغ المُسخن إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم، ثم انقله إلى الغرفة اللاهوائية لحين استخدامه. حمّل ما تبقى من لقاح الأبواغ في محقنة سعة 1 mL متصلة بإبرة تغذية معدية معقمة ذات طرف بصلي. وباستخدام غطاء التدفق الصفائحي، خذ فأراً من عينة الدراسة وثبّت الرأس عن طريق تقييد الحيوان بلطف من الجلد الرخو في منطقة الرقبة والظهر.

باستخدام إصبع السبابة، ومع التأكد من أن الحيوان لا يصدر أصواتاً أو يظهر علامات ضيق، قم بتثبيت رأس الحيوان بشكل أكبر ومدد المريء. حافظ على الفأر في وضع عمودي قائم، ومرر إبرة التغذية القسرية (gavage) بلطف عبر جانب الفم. وجه إبرة التغذية القسرية على طول سقف الفم وادفعها ببطء إلى داخل المريء.

بمجرد وصول الإبرة إلى منتصف المريء تقريباً، احقن 25 µL من لقاح الأبواغ ثم اسحب الإبرة برفق. أعِد الحيوان إلى قفصه، وراقبه بحثاً عن أي علامات للسعال أو ضيق التنفس التي قد تشير إلى إعطاء اللقاح عن طريق الرغامي عن غير قصد. بعد ذلك، خذ جزءاً من لقاح الأبواغ الذي تم تخزينه مسبقاً في الغرفة اللاهوائية، وأي كمية متبقية من لقاح الأبواغ المستخدم في التغذية القسرية، وقم بإجراء تخفيفات تسلسلية من واحدة إلى عشر تخفيفات في 180 µL من 1x PBS.

قم بإجراء أربعة إلى خمسة من هذه التخفيفات. وباستخدام تقنية التعقيم، انقل 100 µL من كل تخفيف تسلسلي إلى طبق TCCFA منفصل. وباستخدام ناشر معقم جديد على شكل حرف L في كل مرة، وزع اللقاحات المخففة بالتساوي على كل طبق.

يتم تحضين الأطباق تحت ظروف لاهوائية لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. وأخيرًا، يتم عد مستعمرات C.difficile في كل طبق تخفيف وحساب وحدات تكوين المستعمرات لتحديد الجرعة المعدية التي تم إعطاؤها للفئران. ولجمع عينات البراز من الفئران لتقييمها، يتم أولاً تثبيت الفأر الخاضع للتجربة برفق ولكن بإحكام عن طريق الجلد الرخو في الرقبة والظهر، مع التأكد من أن الحيوان ليس في حالة ضيق.

باستخدام إصبع الخنصر، ارفع ذيل الحيوان برفق لكشف فتحة الشرج. أمسك بأنبوب طرد مركزي دقيق (microcentrifuge tube) معقم ومعلوم الوزن مباشرة تحت فتحة شرج الحيوان، مع التأكد من أن الأنبوب لا يلامس الفأر بشكل مباشر. وعندما يتبرز الحيوان، اجمع الكريات البرازية في الأنبوب.

تُحفظ الأنابيب في درجة حرارة الغرفة حتى يتم جمع جميع العينات اللازمة. تُوزن الأنابيب التي تحتوي على البراز باستخدام ميزان تحليلي، ويُسجل الكتلة بدقة أربعة منازل عشرية. يتم حساب وزن كريات البراز بطرح وزن الأنبوب.

بعد ذلك، قم بحساب تخفيف بنسبة واحد إلى عشرة للمحتويات وأعد تعليقها في 1x PBS. استخدم طرف الماصة لتفكيك المادة البرازية برفق في المحلول. قم بتحضين العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، للسماح للمحتويات بالترسب.

مع الحفاظ على المحاليل في ظروف لاهوائية، قم بإجراء تخفيفات متسلسلة لكل عينة في 1x PBS. انقل 100 µL من كل تخفيف متسلسل إلى أطباق TCCFA. استخدم ناشراً معقماً على شكل حرف L ووزع المادة بالتساوي على الأطباق.

قم بتحضين الأطباق في ظروف لاهوائية عند 37 degrees celsius لمدة 24 ساعة. وأخيرًا، قم بتعداد مستعمرات C.difficile وحساب وحدة تشكيل المستعمرة لكل جرام من محتوى البراز. يوضح هذا الشكل وزن الفأر في الأيام التي تلت التحدي بـ C.difficile R20291.

في اليوم صفر، تم تعيين الوزن المرجعي عند 100. تم قياس متوسط وزن جسم الفأر يومياً بعد ذلك، ولمدة 14 يوماً. لوحظ انخفاض ملحوظ في الوزن لدى الفئران التي تعرضت للتحدي في الأيام من الثاني إلى السابع بعد التحدي.

بدت الفئران وكأنها تتعافى وتستعيد وزنها بعد هذه النقطة. وهنا، يتم عرض حمولة C.difficile في البراز في الأيام التي تلت التحدي. بعد 24 ساعة من التحدي، كانت جميع الفئران مستعمرة بـ 10^7 CFUs لكل جرام من البراز.

انخفض هذا الحمل الميكروبي اعتباراً من اليوم السابع فصاعداً، رغم استمرار وجود C.difficile. وأظهر الفحص الهيستوباثولوجي للفئران على مدار فترة العدوى أن التغيرات المرضية الأكثر أهمية كانت في الأعور. وكانت درجات التقييم النسيجي الإجمالية للأعور مختلفة بشكل ملحوظ بين اليوم صفر واليومين الثاني والرابع بعد التحدي.

بشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في التعامل مع نموذج الفأر هذا صعوبة في حساب وتحضير لقاح الأبواغ المستخدم لتحدي الفئران، وكذلك في حساب الحمل البكتيري لـ C.difficile في البراز. وأثناء تطبيق هذا البروتوكول، من المهم تذكر أن إجراء تعديلات على الجرعة أو السلالة من أبواغ C.difficile التي تُعطى للفئران قد يغير من نتائج هذا النموذج.