Name: يغرق التجميد: أداة لدراسات التركيبية وImmunolocalization من خلايا تعليق في نقل المجهر (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 35 s
Description: تعلم طريقة التجميد بالغمر لحفظ خلايا التعليق بشكل ممتاز لدراسات التركيب الدقيق والتموضع المناعي باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل. هذه التقنية سهلة الاستخدام ومنخفضة التكلفة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونعرب عن امتناننا لM. Bouchecareilh، E. Tétaud، S. Duvezin-Caubet، وA. ديفين لما قدموه من مساعدة والتعليقات على المخطوطة. ونحن ممتنون إلى القطب التصوير الالكتروني للمركز التصوير بوردو حيث تم التقاط الصور. وأيد هذا العمل من قبل المركز الوطني الفرنسي للبحث العلمي.

<ol><li>Palade, G. E., Porter, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+endoplasmic+reticulum.+I.+Its+identification+in+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ.</a> J Exp Med. 100 (6), 641-656 (1954).</li>
<li>Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artefacts+and+morphological+changes+during+chemical+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Artefacts and morphological changes during chemical fixation.</a> J Microsc. 168 (Pt 2), 181-201 (1992).</li>
<li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+high+pressure+frozen+samples%3A+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).</li>
<li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Out+with+the+old+and+in+with+the+new%3A+rapid+specimen+preparation+procedures+for+electron+microscopy+of+sectioned+biological+material%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material.</a> Protoplasma. 251, 429-448 (2014).</li>
<li>Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+cryofixation+by+high-pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A new approach for cryofixation by high-pressure freezing.</a> J Microsc. 203 (Pt 3), 285-294 (2001).</li>
<li>Bernales, S., McDonald, K. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+counterbalances+endoplasmic+reticulum+expansion+during+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Autophagy counterbalances endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response.</a> PLoS Biol. 4 (12), 2311-2324 (2006).</li>
<li>Kissová, I., Salin, B., Schaeffer, J., Bhatia, S., Manon, S., Camougrand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+non-selective+autophagic+degradation+of+mitochondria+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Selective and non-selective autophagic degradation of mitochondria in yeast.</a> Autophagy. 3 (4), 329-336 (2007).</li>
<li>Gilkey, J. C., Staehling, A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jemt.1060030206/abstract">Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure.</a> Microsc Res Tech. 3 (2), 177-210 (1986).</li>
<li>Nogales, E., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM%3A+A+Unique+Tool+for+the+Visualization+of+Macromolecular+Complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity.</a> Mol Cell. 58 (4), 677-689 (2015).</li>
<li>Baba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy in yeast.</a> Methods Enzymol. 451, 133-149 (2008).</li>
<li>Leunissen, J. L. M., Yi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-pressurized+rapid+freezing+%28SPRF%29%3A+a+novel+cryofixation+method+for+specimen+preparation+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method for specimen preparation in electron microscopy.</a> J Microsc. 235 (1), 25-35 (2009).</li>
<li>Lefebvre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LdFlabarin+a+new+BAR+domain+membrane+protein+of+Leishmania+flagellum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">LdFlabarin a new BAR domain membrane protein of Leishmania flagellum.</a> PLoS One. 8 (9), 1-12 (2013).</li>
<li>Tetaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TbFlabarin%2C+a+flagellar+protein+of+Trypanosoma+brucei%2C+highlights+differences+between+Leishmania+and+Trypanosoma+flagellar-targeting+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">TbFlabarin, a flagellar protein of Trypanosoma brucei, highlights differences between Leishmania and Trypanosoma flagellar-targeting signals.</a> Exp Parasitol. 166, 97-107 (2016).</li>
<li>Wasmer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-state+NMR+spectroscopy+reveals+that+E+coli+inclusion+bodies+of+HET-s%28218-289%29+are+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Solid-state NMR spectroscopy reveals that E coli inclusion bodies of HET-s(218-289) are amyloids.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48 (26), 4858-4860 (2009).</li>
<li>Lefebvre-Legendre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+to+assemble+the+alpha+3+beta+3+subcomplex+of+the+ATP+synthase+leads+to+accumulation+of+the+alpha+and+beta+subunits+within+inclusion+bodies+and+the+loss+of+mitochondrial+cristae+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Failure to assemble the alpha 3 beta 3 subcomplex of the ATP synthase leads to accumulation of the alpha and beta subunits within inclusion bodies and the loss of mitochondrial cristae in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 280 (18), 18386-18389 (2005).</li>
<li>Paumard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ATP+synthase+is+involved+in+generating+mitochondrial+cristae+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology.</a> EMBO J. 21 (3), 221-230 (2002).</li>
<li>Gabriel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fox2-dependent+fatty+acid+%C3%9F-oxidation+pathway+coexists+both+in+peroxisomes+and+mitochondria+of+the+ascomycete+yeast+Candida+lusitaniae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Fox2-dependent fatty acid ß-oxidation pathway coexists both in peroxisomes and mitochondria of the ascomycete yeast Candida lusitaniae.</a> PLoS One. 9 (12), 1-27 (2014).</li>
<li>Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physics+of+rapid+cooling+and+its+implications+for+cryoimmobilization+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells.</a> Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).</li>
<li>Meryman, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+living+cells%3A+principles+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of living cells: principles and practice.</a> Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).</li>
<li>Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close-to-native+ultrastructural+preservation+by+high+pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing.</a> Methods Cell Biol. 88, 151-164 (2008).</li>
<li>Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+high-pressure+freezing+and+quick+freeze+substitution+of+plant+tissues+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy.</a> J Vis Exp. (92), e51844(2014).</li>
<li>Pinan-Lucarré, B., Clavé, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+autophagy+in+the+filamentous+fungus+Podospora+anserina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Monitoring autophagy in the filamentous fungus Podospora anserina.</a> Methods Enzymol. 451, 251-270 (2008).</li>
<li>Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+chemical+fixation+method+suitable+for+immunogold+localization+of+green+fluorescent+protein+in+the+Golgi+apparatus+of+tobacco+Bright+Yellow+%28BY-2%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells.</a> J Histochem Cytochem. 51 (7), 931-940 (2003).</li>
<li>Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+high+pressure+freezing+and+freeze+substitution+method+to+preserve+the+labile+vaccinia+virus+nucleocapsid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid.</a> J Struct Biol. 195 (1), 41-48 (2016).</li>
</ol>

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم تضارب المصالح.

تيم هو وسيلة قوية لمراقبة التركيبية لعضيات الخلايا والأنسجة. Cryofixation / تجميد الاستبدال هو حاليا أفضل طريقة للحفاظ على حد سواء التركيب الدقيق والبروتين استضداد. المثبتات الكيميائية تخترق وتعمل ببطء شديد مما يتيح إعادة ترتيب الهيكلية قبل أن يتم تثبيت كاملة من التركيب الدقيق 2. على العكس من ذلك، cryofixation / تجميد استبدال يستقر على الفور الهياكل الخلوية (4). ومع ذلك، تتضمن تقنيات cryofixation / تجميد استبدال عدد من المعوقات والصع...

إعداد عينة أمر بالغ الأهمية لنجاح أي دراسة المجهر الإلكتروني. كان التقليدية EM تثبيت الوسيلة الرئيسية لتحديد الأنسجة أو الخلايا للانتقال المجهر الإلكتروني (TEM) 1. أولا، يتم استخدام الألدهيدات ورباعي أكسيد الأوزميوم لإصلاح كيميائيا المواد في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، يتم المجففة المواد مع المذيبات العضوية، تسلل، وجزءا لا يتجزأ من راتنجات الايبوكسي. هذا الأسلوب يعتمد على معدل تغلغل المثبتات في الخلية. وبالتالي، فإن القطع الأثرية واستخراج محتويات الخلوية وعادة ما تكون لاحظت 2. Cryofixation ومن الواضح أن البديل الأفضل للحفاظ على الهياكل الخلوية 3، وحفظ لهم سليمة. أعلى مستوى من الجودة من الصور TEM 4 في أقسام الراتنج رقيقة يمكن الحصول عليها باستخدام طريقة الاستبدال cryofixation / التجميد. والهدف من هذه التقنية هو الحصول على نصف المزججعينات ological دون تشكيل بلورات الثلج أو التي تحتوي على بلورات الثلج الصغيرة بما يكفي كي لا تلحق الضرر التركيب الدقيق للخلايا. تجميد الضغط العالي (HPF) وcryofixation فائقة سريعة، وهو ما يسمى أيضا يغرق التجمد (PF)، طريقتان لcryofix العينات. HPF يشل الجزيئات في خلية على الفور والابتعاد عن الأضرار الناجمة عن تثبيت EM التقليدية. وقد تم تطوير عدة أنواع من آلات تجميد والأجهزة الاستبدال التلقائي 5. آلات التجميد والمواد الاستهلاكية (النيتروجين السائل، عينة الناقلين، الخ) غالية الثمن، لكنها تسمح لإنتاج الميكروسكوب الإلكتروني ذات جودة عالية 6، 7. PF هو الاسلوب الذي تم استخدامه في أوائل 1950s، ويوصف في الأدبيات بسيطة ورخيصة 8. وخلال إجراء PF، يتم تجميد العينة مستعدة بمعدل سريع للحصول على بلورات الثلج حجم أقل من 3 إلى 5 نانومتر. تحقيقا لهذه الغاية، والعينةسقطت في كريوجين السائل، مثل الإيثان والبروبان، أو خليط الإيثان والبروبان. منذ 1950s، وقد تم القيام به تحسينات PF لجعل هذه التقنية متاحة لعدد أكبر من المستخدمين. ارتفاع ضغط التجميد هو حاليا السبيل الوحيد لتجميد مجموعة كبيرة ومتنوعة من نماذج سمكا من 50 ميكرون (تصل إلى سمك 200 ميكرون لعينات على شكل قرص) 5، في حين يستخدم PF على نطاق واسع لصورة الأشياء الصغيرة (&lt;100 نانومتر )، مثل المجمعات الجزيئات العالقة في طبقة رقيقة من الجليد غير متبلور 9. عينات أكبر، على سبيل المثال خلايا حقيقية النواة، يمكن cryofixed التي كتبها PF، ولكنها تتطلب عينة أصحاب، مثل الأنابيب الشعرية النحاس أو أنظمة ساندويتش 8 و 10 و 11. هنا، وسريعة وسهلة الاستخدام ومنخفضة التكلفة يغرق التكنولوجيا تجميد / تجميد الاستبدال التي يمكن استخدامها لمختلف الثقافات تعليق خلية يرد.

<table><tbody><tr><td>الشبكات</td><td>علوم المجهر الإلكتروني</td><td>T400-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Formvar</td><td>علوم المجهر الإلكتروني</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>البروبان N35</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>النيتروجين</td><td></td><td></td><td></td>السائل</tr><tr><td>إبرة تشريح مزدوجة</td><td>الحواف علوم المجهر الإلكتروني</td><td>72947</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>علوم المجهر الإلكتروني</td><td>61802-02</td><td></td></tr><tr><td>علوم المجهر</td> الإلكتروني<td>لرابعي أكسيد الأوزميوم</td><td>19130</td><td></td></tr><tr><td>قارورة زجاجية 8.5 مل</td><td>علوم المجهر الإلكتروني</td><td>64252</td><td></td></tr><tr><td>أسيتات اليورانيل</td><td>علوم المجهر الإلكتروني</td><td>48851</td><td></td></tr><tr><td>الأسيتون</td><td>سيجما</td><td>32201</td><td></td></tr><tr><td>الإيثانول 100٪</td> <td>سيجما</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>زجاج شرائح</td><td>VWR الدولية</td><td>631-9439</td><td></td></tr><tr><td>ملاقط</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>راتنج أكريليك</td><td>علوم المجهر الإلكتروني</td><td>104371</td><td></td></tr><tr><td>راتنجات الايبوكسي M</td><td>Sigma</td><td>10951</td><td></td></tr><tr><td>راتنجات الايبوكسي M مقوي</td><td>Sigma</td><td>10953</td><td></td></tr><tr><td>ثنائي بوتيل phtalate&nbsp;</td><td>سيجما</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>راتنجات الايبوكسي M تسريع</td><td>سيجما</td><td>10952</td><td></td></tr><tr><td>بلورة</td><td>فيشر العلمية</td><td>08-762-9</td><td></td></tr><tr><td>جوزيف ورقة</td><td>VWR الدولية</td><td>111-5009</td><td></td></tr><tr><td>أكواب</td><td></td><td></td> نحاسية <td>تفعل ذلك بنفسك تسوق أو مصنوعة</td></tr> <tr><td>بنفسك خميرة الخميرة </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shizosacharomyces cerevisiae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypanosoma brucei</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leishmania amazonensis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>مربع محكم</td><td>فيشر العلمي</td><td>7135-0001 &nbsp ؛</td><td></td></tr><tr><td>جهاز تنقية الهواء</td><td>Fischer Scientific</td><td>3M 7502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>خرطوشة لجهاز التنفس</td> الصناعي <td>Fischer Scientific</td><td>3M 6001</td><td></td></tr><tr><td>مرشح الجسيمات</td><td>Fischer Scientific</td><td>3M 5N11 &nbsp ؛</td><td></td></tr></tbody></table>

يغرق التجميد: أداة لدراسات التركيبية وimmunolocalization من خلايا تعليق في نقل المجهر

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

انتقال المجهر الإلكتروني (TEM) هو أداة استثنائية لدراسة التركيب الدقيق خلية، من أجل توطين البروتينات وتصور المجمعات الجزيئات في دقة عالية جدا. ومع ذلك، للحصول على أقرب ما يمكن إلى الدولة الأم، مطلوب الكمال الحفاظ على العينة. التقليدية المجهر الإلكتروني (EM) التثبيت مع الألدهيدات، على سبيل المثال، لا يوفر الحفاظ التركيبية جيد. اختراق البطيء للمثبتات يدفع إعادة تنظيم الخلايا وفقدان مكونات الخلية المختلفة. لذلك، EM تثبيت التقليدي لا يسمح لاستقرار لحظية والحفاظ على الهياكل واستضداد. أفضل خيار لدراسة الأحداث داخل الخلية هو استخدام cryofixation تليها طريقة تثبيت تجميد الاستبدال التي تحافظ على خلايا في حالتها الأصلية. الضغط العالي تجميد / تجميد الاستبدال، الذي يحافظ على سلامة التركيب الدقيق الخلوية، هو الأسلوب الأكثر شيوعا، ولكن يتطلب expensiلقد المعدات. هنا، يتم تقديم وسيلة سهلة الاستخدام والتكلفة المنخفضة للتجمد تثبيت تليها تجميد استبدال لمزارع الخلايا تعليق.

في هذه المقالة، يتم تقديم وسيلة تجميد سهلة الاستخدام وانخفاض التكلفة المنخفضة لالتركيبية (الشكلان 1 و الشكل 2) وimmunolabeling (الشكل 3) دراسات. علينا أن نبرهن على أنه ليس من الضروري أن يكون المعدات الخاصة لهذا الإجراء تجميد الإحلال وأن الإجراء الاحترار تستغرق أقل من 6 ساعات بدلا من 24 ساعة باستخدام نظام مخصص. <p class="jove_content" fo:keep-together.withi...

تصف هذه المخطوطة وسيلة سهلة الاستخدام ومنخفضة التكلفة كريوفيكساتيون لتصور خلايا تعليق عن طريق انتقال المجهر الإلكتروني.

يغرق التجميد: أداة لدراسات التركيبية وImmunolocalization من خلايا تعليق في نقل المجهر

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

الهدف من التجارب التالية هو اقتراح أداة لدراسات البنية التحتية والمناعية لخلايا التعليق للتصور في المجهر الإلكتروني للإرسال. هذه التقنية سهلة الاستخدام ومنخفضة التكلفة وتوفر الحفاظ على البنية الخلوية بشكل ممتاز. هذه ثقافة الخلايا المعلقة.أولا ، يتم حصاد الخلايا بواسطة أجهزة طرد مركزي مختلفة للحصول على حبيبات في أنبوب طرد مركزي دقيق. في الخطوة الثانية ، يتم تجميد العينة بسرعة عن طريق التجميد الغاطس الذي يشل حركة الخلايا ويحد من تكوين بلورات الجليد. بعد ذلك ، يتم إجراء استبدال التجميد من أجل استبدال الماء بمذيب يحتوي على رابع أكسيد الأوزميوم كمثبت لتثبيت هياكل الخلايا.تظهر النتائج أن التجميد الغاطس ، واستبدال التجميد ، يحافظان تماما على البنية التحتية للخلايا. كان التثبيت الكيميائي طريقة أساسية لتثبيت الأنسجة أو الخلايا للفحص المجهري الإلكتروني للإرسال ، ولكن بهذه الطريقة ، عادة ما يتم ملاحظة القطع الأثرية واستخراج المحتويات الخلوية. بديل للتثبيت الكيميائي هو التثبيت بالتبريد.تمثل هذه الطريقة الخيار الأفضل لإنتاج أعلى جودة من التشكل في أقسام الراتنج الرقيقة. التجميد الغاطس هو تقنية تثبيت بالتبريد تعمل على تثبيت الجزيئات في الخلية على الفور لتجنب التلف الناجم عن التثبيت الكيميائي التقليدي. قبل تجميد العينة ، يجب تحضير الشبكة المقطوعة بفيلم Formvar لاستخدامها كدعم للتجميد.قم بتلميع الزجاج بقطعة قماش خالية من النسالة حتى يصبح لامعا ويمسح نظيفا. اغمس الشريحة الزجاجية في محلول فورمفار 0.3٪ في الكلوروفورم لبضع ثوان واتركها لتجف في دورق مستقيم. يجب أن يتم التلاعب تحت غطاء الدخان باستخدام معدات الحماية الشخصية بسبب وجود الكلوروفورم.بعد ملء جهاز التبلور بالماء المقطر ، قم بتمرير شريط زجاجي فوق سطح الماء لإزالة الغبار. عندما يجف الفيلم ، قم بتقطيع الحواف بشفرة حلاقة حادة حتى يرفع الفيلم. قم بتجميد الشريحة عن طريق الزفير بقوة على الشريحة للحصول على طبقة من بخار الماء على الفيلم.قم بتعويم الفيلم على الفور على سطح الماء عن طريق لمس الجزء السفلي من الشريحة بزاوية حوالي 30 درجة على سطح الماء. قم بخفض الشريحة ببطء في الحمام ، وقم بإزالة الفيلم حسب الضرورة. يستقر فيلم Formvar ببطء على سطح الماء.قم بتوصيل الفيلم على حافة جهاز البلورة باستخدام الملقط. ضع الشبكات النحاسية الشبكية 400 برفق على الفيلم في المناطق ذات السماكة المناسبة وبدون تجاعيد. يتم التقاط الفيلم ذو الشبكات عن طريق تغطيتها بورق جوزيف بينما تطفو على سطح الماء.التقط حافة ورقة جوزيف ويجب أن يأتي الفيلم مع الشبكات. لا تدع أصابعك تلمس سطح الماء وإلا فإنك تخاطر بترك فيلم في الماء. اترك الشبكات تجف قبل عدة ساعات من استخدامها.بالنسبة لدراسات البنية التحتية ، ضع أمبولة رابع أكسيد الأوزميوم في قارورة زجاجية. رج القارورة جيدا لكسر الأمبولة. أضف حجما مناسبا من الأسيتون 100٪ للحصول على تركيز نهائي يبلغ 4٪ حرك القارورة التي تحتوي على وسط استبدال التجميد ، وقم بتوزيع 1.5 ملليلتر من الحصص في المبردات باستخدام ماصة نقل البلاستيك.أغلق جميع الأغطية واحفظها في الفريزر على حرارة 84 درجة تحت الصفر قبل الاستخدام. لدراسات وضع العلامات المناعية للبروتين ، قم بإعداد 0.1٪ من أسيتات اليورانيل في الأسيتون. عندما يصبح المحلول صافيا ، قم بالترشيح باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر وتوزيع 1.5 ملليلتر من الحصص في المبردات.يحفظ في الفريزر على حرارة 84 درجة تحت الصفر قبل الاستخدام. للتأكد من أن لديك الاتساق المناسب للكريات من أنواع مختلفة من الخلايا ، خلايا الخميرة الخام في الحد الأدنى من وسط السائل الكامل للحصول على واحد 10 إلى الخلايا التسع. الإشريكية القولونية في وسط DTY للحصول على خمس خلايا بكتيرية من 10 إلى 10.الليشمانيا السوط في وسط AM و Trypanosoma brucei في وسط SDM79 للحصول على خمس خلايا طفيلية 10 إلى ثماني خلايا طفيلية. انقل وسط الاستزراع الذي يحتوي على خلايا معلقة إلى أنبوب بروبيلين سعة 50 مليلتر وجهاز طرد مركزي لمدة ثلاث دقائق عند 1,500 جم. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من وسط زراعة الخلايا المعنية.جهاز طرد مركزي في أنبوب طرد مركزي دقيق لمدة دقيقة واحدة عند 3،900 جم. قم بإزالة المادة الطافية تماما. بالنسبة لطريقة التجميد بالغرق ، يجب استخدام زجاجة البروبان مع أنبوب متصل بأسطوانة البروبان.البروبان الذي يحتمل أن يكون متفجرا ، أدرك التسييل في غرفة جيدة التهوية أو في غطاء الدخان. لا يسمح باللهب المكشوف. يجب دائما ارتداء معدات الحماية الشخصية بما في ذلك القرفاق البردية عند استخدام النيتروجين السائل.ضعي كمية قليلة من النيتروجين السائل في صينية البوليسترين. ضع الكوب النحاسي في النيتروجين السائل. تظهر الفقاعات.انتظر حتى تهدأ الفقاعات. ثم يتم تجميد الكوب النحاسي. ضع الأنبوب المتصل بأسطوانة البروبان على اتصال بجدار الغطاء النحاسي.افتح صمام أسطوانة البروبان برفق. يتشكل الكثير من الدخان لأن البروبان لا يبدأ في التسييل. عندما يبدأ البروبان في التسييل ، يختفي الدخان.أوقف التسييل عن طريق إغلاق صمام أسطوانة البروبان وإزالة الأنبوب المتصل بأسطوانة البروبان بسرعة. املأ صينية البوليسترين بالنيتروجين السائل حتى خمسة ملليمترات من أعلى الكوب النحاسي. قم بتجميد أكواب نحاسية صغيرة حيث سنستبدل العينة بعد التجميد بوضعها في النيتروجين السائل.ضع كوبا واحدا لعينة واحدة. احرص على عدم خلط العينات. للحصول على الاتساق المناسب للحبيبات ، من الضروري فقط احترام ظروف الاستزراع ومعلمات الطرد المركزي المشار إليها سابقا.قم بتجميد الملقط قبل استخدامه. خذ شبكة مجهرية نحاسية 400 شبكة مقطوعة ب Formvar. اغمر إبرة تشريح مزدوجة الحواف في الحبيبات.ضع ، باستخدام الأداة ، قطرة من الحبيبات على الشبكة. اغمر الشبكة بسرعة كبيرة في البروبان السائل وحرك بضع ثوان. انقل الشبكة المجمدة بسرعة في الكوب النحاسي الصغير.لكل عينة ، قم بعمل ثلاث شبكات على الأقل. لا تنس تجميد الملقط قبل تناول الشبكة. قم بتجميد الملقط قبل استخدامه.قم بإزالة الكوب بسرعة وانقل الشبكات المجمدة إلى الثلاجة باستخدام الملقط. ضع الغطاء مرة أخرى على التبريد. كرر العملية لكل شبكة من كل عينة.أغلق الأغطية وحرك التبريد للتأكد من أن العينات في وسط استبدال التجميد. دع التبريد لمدة ثلاثة أيام في الفريزر 84 درجة تحت الصفر. احمل المبردات في صينية البوليسترين لتجنب الارتفاع المفاجئ في درجة الحرارة إلى الفريزر 30 درجة تحت الصفر.دع ساعة واحدة عند 30 درجة تحت الصفر. احمل المبردات عند 15 درجة تحت الصفر لمدة ساعتين ، ثم ضع العينات على أربع درجات لمدة ساعتين ، و 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة وسيط استبدال التجميد باستخدام ماصات نقل البلاستيك وضعها في زجاجة نفايات مناسبة محددة بوضوح.ضع حوالي 500 ميكرولتر من الأسيتون بنسبة 100٪. افتح القارورة الزجاجية وحرك التجميد ووضع وسط استبدال التجميد بسرعة في قارورة زجاجية. اشطف واحدة من الكريوفيال باستخدام الأسيتون بنسبة 100٪.اشطف ثلاث مرات 10 دقائق باستخدام 100٪ أسيتون. احمل المبردات في صينية البوليسترين لتجنب الارتفاع المفاجئ في درجة الحرارة إلى الفريزر 30 درجة تحت الصفر. دع ساعتين عند 30 درجة تحت الصفر.بعد وضع العينات في قارورة بولي بروبلين ، استبدل وسط استبدال التجميد بوسط استبدال التجميد الطازج واتركه ساعتين عند 30 درجة تحت الصفر. اشطف ساعة واحدة ب 100٪ أسيتون وثلاث مرات ساعة واحدة بنسبة 100٪ إيثانول. أدت طريقة استبدال التجميد / التجميد الغرق إلى الحفاظ بشكل ممتاز على الهياكل داخل الخلايا لخلايا التعليق.في خميرة الخميرة ، لا تتقلص الهياكل ويبدو السيتوبلازم كثيفا. علاوة على ذلك ، فإن الأغشية ناعمة ، وهو دليل على الحفاظ الجيد. يمكن التعرف على جميع العضيات ، مثل النواة والميتوكوندريا والفجوات بشكل مثالي.لوحظ أيضا حفظ ممتاز في سوط الليشمانيا ، والمثقبية البروسي ، والإشريكية القولونية. في النواة ، يكون الغشاء المزدوج الذي يشكل الغلاف النووي ، والمسام النووية ، وجسم عمود المغزل ، والريبوسومات المتصلة بالغشاء الخارجي للغلاف النووي مرئية بوضوح. في الميتوكوندريا ، تكون غزوات الغشاء الداخلي ، التي تسمى cristae ، مرئية بوضوح.العضيات الحرجة هي الفجوات ، لأن بلورات الجليد الكبيرة يمكن أن تتطور بسهولة. في الصورة ، يتم الحفاظ على الفجوات بشكل مثالي دون تلف بلورات الجليد. يمكن أيضا استخدام طريقة استبدال التجميد / التجميد الغرق لأداء توطين البروتين المناعي.يحافظ الإجراء على مضادات البروتين تماما ، وكما ذكرنا سابقا ، يتم تحديد العضيات بوضوح. تم بالفعل اختبار الأجسام المضادة المختلفة لاستهداف بروتينات مختلفة في الخميرة ، مثل سينسيز مضاد ATP ومضاد للبورين. مثل هذه التجربة ممكنة أيضا لأنظمة تجريبية مختلفة ، كما هو الحال في الليشمانيا ، حيث تم توطين بروتين فلابارين.بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير العينات باستخدام طريقة استبدال التجميد / التجميد الغرق لتصورها في المجهر الإلكتروني للإرسال. هذه التقنية سريعة وسهلة الاستخدام ومنخفضة التكلفة وتوفر الحفاظ الممتاز على البنى التحتية للخلايا. كن حذرا مع النيتروجين السائل ، ولكن بشكل خاص مع رابع أكسيد الأوزميوم وخلات اليورانيل.يجب التعامل معها في غطاء الدخان أثناء ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك معطف المختبر والقفازات.

plunge-freezing-tool-for-ultrastructural-immunolocalization-studies

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

نحن هنا لتوضيح كيفية استخدام الإلكترون cryotomography (ECT) لدراسة التركيب الدقيق للخلايا بكتيرية في القريب الناطقين الدول ، والى "الجزيئات" (~ 4 نانومتر) القرار.

الإلكترون Cryotomography من الخلايا البكتيرية

للحفاظ على العمليات العصبية لتحليل التركيبية، ونحن تصف بروتوكول للتصفيح من الخلايا العصبية في المقام الأول على شبكات المجهر الإلكتروني تليها فلاش تجميد، مما أسفر عن عينات معلقة في طبقة من الجليد الزجاجي. يمكن فحص هذه العينات باستخدام المجهر البرد الإلكترون لتصور هياكل على مقياس متناهي الصغر.

إعداد الخلايا العصبية الأولية للتصور neurites التي في دولة مجمدة رطب عن طريق التصوير المقطعي البرد الإلكترون

ويرد التقنيات الأساسية والتحسينات معالجة تجميد كسر العينات والمواد النانوية البيولوجية للفحص بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ. هذا الأسلوب هو الأسلوب المفضل للكشف عن الملامح التركيبية والتخصصات الأغشية البيولوجية وللحصول على البيانات والأبعاد المكانية مستوى التركيبية في علوم المواد وتكنولوجيا النانو المنتجات.

العناصر الفنية الأساسية من تجميد كسر / تجميد حفر في البيولوجية المجهر الإلكتروني

يعد الحصول على صور مجهرية إلكترونية عالية الجودة أمرا صعبا ، خاصة في حالة الخلايا النباتية ، التي تحتوي على فجوات كبيرة مملوءة بالماء ومساحات جيدة التهوية. يقلل التجميد بالضغط العالي جنبا إلى جنب والاستبدال السريع للتجميد بشكل كبير من وقت تحضير عينات النبات ل TEM مع إنتاج عينات مع الحفاظ على البنية التحتية الممتازة.

جنبا إلى جنب تجميد الضغط العالي والسريع تجميد استبدال الأنسجة النباتية للنقل المجهر الإلكتروني

قمنا بتطوير تقنية جديدة في المجهر الإلكتروني، "فلاش والتجميد" التي تمكن من تصور ديناميات الغشاء مع مللي القرار الزماني. هذا الأسلوب يجمع بين التحفيز علم البصريات الوراثي للخلايا العصبية مع ارتفاع ضغط التجمد. هنا، علينا أن نظهر للإجراءات ووصف البروتوكولات في التفاصيل.

فلاش وتجميد: تقنية جديدة لالتقاط غشاء حيوية مع المجهر الإلكتروني

ويرد هنا بروتوكول لثقافة الخلية علي الاغشيه نيتريد السيليكون ويغرق-تجميد قبل التصوير الشعاعي الاشعه السينية مع السنكروتروني المبردة الاشعه السينية نانوسبر. عندما يتم توفير درجه حرارة الغرفة فقط نانو التحليل ، يمكن ان تكون العينات المجمدة مزيد من التجميد المجفف. هذه هي الخطوات الحاسمة للحصول علي معلومات حول تكوين عنصري داخل الخلايا.

ثقافة الخلية علي اغشيه نيرايد السيليكون والتعويض عن البرد لل Synchrotron الاشعه السينية الفلورية نانو-تحليل

هنا ، يتم تقديم بروتوكول يصف خطوات إعداد العينات وجمع البيانات المطلوبة في التصوير المقطعي بالأشعة السينية الناعمة بالتبريد (SXT) لتصوير البنية الفائقة للخلايا المحفوظة بالتبريد بالكامل بدقة 25 نانومتر نصف الملعب.

وصف رسم الخرائط 3D للخلية بواسطة التصوير المقطعي بالأشعة السينية الناعمة Cryo

هنا نعرض كيفية استخدام جهاز تجميد شطيرة للتجميد السريع للعينات البيولوجية، بما في ذلك البكتيريا والخميرة والخلايا المستزرعة والخلايا المعزولة والأنسجة الحيوانية والبشرية، والفيروسات. كما نعرض كيفية إعداد العينات للقسمة فائقة بعد التجميد السريع.

التجميد السريع باستخدام جهاز تجميد ساندويتش للحفاظ على البنية الفائقة جيدة من العينات البيولوجية في المجهر الإلكترون

تحدد هذه المخطوطة طريقة النشاف والغطس لتجميد العينات البيولوجية يدويا للفحص المجهري الإلكتروني المبرد بجسيمات واحدة.

دليل لطخة والغطس تجميد العينات البيولوجية للجسيمات المفردة المجهر الإلكترون المبردة

هنا ، نقدم خط أنابيب لطحن شعاع الأيونات المركز 3D على توجيه إعداد العينات الخلوية للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد. يتم تحديد موقع 3D للبروتينات الموسومة بالفلورسنت ذات الأهمية أولا بواسطة الفحص المجهري الفلوري بالتبريد ، ثم يتم استهدافه للطحن. البروتوكول مناسب للثدييات والخميرة والخلايا البكتيرية.

إعداد العينة بواسطة طحن شعاع الأيونات المركز 3D للتصوير المقطعي عالي الدقة للإلكترون بالتبريد

يوضح بروتوكول الفيديو هذا كيفية إجراء التصوير المقطعي المجهري الإلكتروني للعينات الفيروسية. للحصول على أفضل النتائج ، يتم تحضير العينات عن طريق التجميد بالضغط العالي واستبدال التجميد اللاحق.

التصوير المقطعي بالفحص المجهري الإلكتروني في علم الفيروسات: التصوير ثلاثي الأبعاد للعينات المجمدة عالية الضغط والاستبدال بالتجميد

تعلم طريقة التجميد بالغمر لحفظ خلايا التعليق بشكل ممتاز لدراسات التركيب الدقيق والتموضع المناعي باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل. هذه التقنية سهلة الاستخدام ومنخفضة التكلفة.

يغرق التجميد: أداة لدراسات التركيبية وImmunolocalization من خلايا تعليق في نقل المجهر

استكشف المزيد من الفيديوهات