يغرق التجميد: أداة لدراسات التركيبية وImmunolocalization من خلايا تعليق في نقل المجهر

الهدف من التجارب التالية هو اقتراح أداة لدراسات البنية التحتية والمناعية لخلايا التعليق للتصور في المجهر الإلكتروني للإرسال. هذه التقنية سهلة الاستخدام ومنخفضة التكلفة وتوفر الحفاظ على البنية الخلوية بشكل ممتاز. هذه ثقافة الخلايا المعلقة.

أولا ، يتم حصاد الخلايا بواسطة أجهزة طرد مركزي مختلفة للحصول على حبيبات في أنبوب طرد مركزي دقيق. في الخطوة الثانية ، يتم تجميد العينة بسرعة عن طريق التجميد الغاطس الذي يشل حركة الخلايا ويحد من تكوين بلورات الجليد. بعد ذلك ، يتم إجراء استبدال التجميد من أجل استبدال الماء بمذيب يحتوي على رابع أكسيد الأوزميوم كمثبت لتثبيت هياكل الخلايا.

تظهر النتائج أن التجميد الغاطس ، واستبدال التجميد ، يحافظان تماما على البنية التحتية للخلايا. كان التثبيت الكيميائي طريقة أساسية لتثبيت الأنسجة أو الخلايا للفحص المجهري الإلكتروني للإرسال ، ولكن بهذه الطريقة ، عادة ما يتم ملاحظة القطع الأثرية واستخراج المحتويات الخلوية. بديل للتثبيت الكيميائي هو التثبيت بالتبريد.

تمثل هذه الطريقة الخيار الأفضل لإنتاج أعلى جودة من التشكل في أقسام الراتنج الرقيقة. التجميد الغاطس هو تقنية تثبيت بالتبريد تعمل على تثبيت الجزيئات في الخلية على الفور لتجنب التلف الناجم عن التثبيت الكيميائي التقليدي. قبل تجميد العينة ، يجب تحضير الشبكة المقطوعة بفيلم Formvar لاستخدامها كدعم للتجميد.

بتلميع الزجاج بقطعة قماش خالية من النسالة حتى يصبح لامعا ويمسح نظيفا. اغمس الشريحة الزجاجية في محلول فورمفار 0.3٪ في الكلوروفورم لبضع ثوان واتركها لتجف في دورق مستقيم. يجب أن يتم التلاعب تحت غطاء الدخان باستخدام معدات الحماية الشخصية بسبب وجود الكلوروفورم.

بعد ملء جهاز التبلور بالماء المقطر ، قم بتمرير شريط زجاجي فوق سطح الماء لإزالة الغبار. عندما يجف الفيلم ، قم بتقطيع الحواف بشفرة حلاقة حادة حتى يرفع الفيلم. قم بتجميد الشريحة عن طريق الزفير بقوة على الشريحة للحصول على طبقة من بخار الماء على الفيلم.

بتعويم الفيلم على الفور على سطح الماء عن طريق لمس الجزء السفلي من الشريحة بزاوية حوالي 30 درجة على سطح الماء. قم بخفض الشريحة ببطء في الحمام ، وقم بإزالة الفيلم حسب الضرورة. يستقر فيلم Formvar ببطء على سطح الماء.

قم بتوصيل الفيلم على حافة جهاز البلورة باستخدام الملقط. ضع الشبكات النحاسية الشبكية 400 برفق على الفيلم في المناطق ذات السماكة المناسبة وبدون تجاعيد. يتم التقاط الفيلم ذو الشبكات عن طريق تغطيتها بورق جوزيف بينما تطفو على سطح الماء.

التقط حافة ورقة جوزيف ويجب أن يأتي الفيلم مع الشبكات. لا تدع أصابعك تلمس سطح الماء وإلا فإنك تخاطر بترك فيلم في الماء. اترك الشبكات تجف قبل عدة ساعات من استخدامها.

بالنسبة لدراسات البنية التحتية ، ضع أمبولة رابع أكسيد الأوزميوم في قارورة زجاجية. رج القارورة جيدا لكسر الأمبولة. أضف حجما مناسبا من الأسيتون 100٪ للحصول على تركيز نهائي يبلغ 4٪ حرك القارورة التي تحتوي على وسط استبدال التجميد ، وقم بتوزيع 1.5 ملليلتر من الحصص في المبردات باستخدام ماصة نقل البلاستيك.

أغلق جميع الأغطية واحفظها في الفريزر على حرارة 84 درجة تحت الصفر قبل الاستخدام. لدراسات وضع العلامات المناعية للبروتين ، قم بإعداد 0.1٪ من أسيتات اليورانيل في الأسيتون. عندما يصبح المحلول صافيا ، قم بالترشيح باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر وتوزيع 1.5 ملليلتر من الحصص في المبردات.

يحفظ في الفريزر على حرارة 84 درجة تحت الصفر قبل الاستخدام. للتأكد من أن لديك الاتساق المناسب للكريات من أنواع مختلفة من الخلايا ، خلايا الخميرة الخام في الحد الأدنى من وسط السائل الكامل للحصول على واحد 10 إلى الخلايا التسع. الإشريكية القولونية في وسط DTY للحصول على خمس خلايا بكتيرية من 10 إلى 10.

الليشمانيا السوط في وسط AM و Trypanosoma brucei في وسط SDM79 للحصول على خمس خلايا طفيلية 10 إلى ثماني خلايا طفيلية. انقل وسط الاستزراع الذي يحتوي على خلايا معلقة إلى أنبوب بروبيلين سعة 50 مليلتر وجهاز طرد مركزي لمدة ثلاث دقائق عند 1,500 جم. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من وسط زراعة الخلايا المعنية.

جهاز طرد مركزي في أنبوب طرد مركزي دقيق لمدة دقيقة واحدة عند 3،900 جم. قم بإزالة المادة الطافية تماما. بالنسبة لطريقة التجميد بالغرق ، يجب استخدام زجاجة البروبان مع أنبوب متصل بأسطوانة البروبان.

البروبان الذي يحتمل أن يكون متفجرا ، أدرك التسييل في غرفة جيدة التهوية أو في غطاء الدخان. لا يسمح باللهب المكشوف. يجب دائما ارتداء معدات الحماية الشخصية بما في ذلك القرفاق البردية عند استخدام النيتروجين السائل.

ضعي كمية قليلة من النيتروجين السائل في صينية البوليسترين. ضع الكوب النحاسي في النيتروجين السائل. تظهر الفقاعات.

انتظر حتى تهدأ الفقاعات. ثم يتم تجميد الكوب النحاسي. ضع الأنبوب المتصل بأسطوانة البروبان على اتصال بجدار الغطاء النحاسي.

افتح صمام أسطوانة البروبان برفق. يتشكل الكثير من الدخان لأن البروبان لا يبدأ في التسييل. عندما يبدأ البروبان في التسييل ، يختفي الدخان.

أوقف التسييل عن طريق إغلاق صمام أسطوانة البروبان وإزالة الأنبوب المتصل بأسطوانة البروبان بسرعة. املأ صينية البوليسترين بالنيتروجين السائل حتى خمسة ملليمترات من أعلى الكوب النحاسي. قم بتجميد أكواب نحاسية صغيرة حيث سنستبدل العينة بعد التجميد بوضعها في النيتروجين السائل.

ضع كوبا واحدا لعينة واحدة. احرص على عدم خلط العينات. للحصول على الاتساق المناسب للحبيبات ، من الضروري فقط احترام ظروف الاستزراع ومعلمات الطرد المركزي المشار إليها سابقا.

قم بتجميد الملقط قبل استخدامه. خذ شبكة مجهرية نحاسية 400 شبكة مقطوعة ب Formvar. اغمر إبرة تشريح مزدوجة الحواف في الحبيبات.

ضع ، باستخدام الأداة ، قطرة من الحبيبات على الشبكة. اغمر الشبكة بسرعة كبيرة في البروبان السائل وحرك بضع ثوان. انقل الشبكة المجمدة بسرعة في الكوب النحاسي الصغير.

لكل عينة ، قم بعمل ثلاث شبكات على الأقل. لا تنس تجميد الملقط قبل تناول الشبكة. قم بتجميد الملقط قبل استخدامه.

قم بإزالة الكوب بسرعة وانقل الشبكات المجمدة إلى الثلاجة باستخدام الملقط. ضع الغطاء مرة أخرى على التبريد. كرر العملية لكل شبكة من كل عينة.

أغلق الأغطية وحرك التبريد للتأكد من أن العينات في وسط استبدال التجميد. دع التبريد لمدة ثلاثة أيام في الفريزر 84 درجة تحت الصفر. احمل المبردات في صينية البوليسترين لتجنب الارتفاع المفاجئ في درجة الحرارة إلى الفريزر 30 درجة تحت الصفر.

دع ساعة واحدة عند 30 درجة تحت الصفر. احمل المبردات عند 15 درجة تحت الصفر لمدة ساعتين ، ثم ضع العينات على أربع درجات لمدة ساعتين ، و 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة وسيط استبدال التجميد باستخدام ماصات نقل البلاستيك وضعها في زجاجة نفايات مناسبة محددة بوضوح.

ضع حوالي 500 ميكرولتر من الأسيتون بنسبة 100٪. افتح القارورة الزجاجية وحرك التجميد ووضع وسط استبدال التجميد بسرعة في قارورة زجاجية. اشطف واحدة من الكريوفيال باستخدام الأسيتون بنسبة 100٪.

اشطف ثلاث مرات 10 دقائق باستخدام 100٪ أسيتون. احمل المبردات في صينية البوليسترين لتجنب الارتفاع المفاجئ في درجة الحرارة إلى الفريزر 30 درجة تحت الصفر. دع ساعتين عند 30 درجة تحت الصفر.

بعد وضع العينات في قارورة بولي بروبلين ، استبدل وسط استبدال التجميد بوسط استبدال التجميد الطازج واتركه ساعتين عند 30 درجة تحت الصفر. اشطف ساعة واحدة ب 100٪ أسيتون وثلاث مرات ساعة واحدة بنسبة 100٪ إيثانول. أدت طريقة استبدال التجميد / التجميد الغرق إلى الحفاظ بشكل ممتاز على الهياكل داخل الخلايا لخلايا التعليق.

في خميرة الخميرة ، لا تتقلص الهياكل ويبدو السيتوبلازم كثيفا. علاوة على ذلك ، فإن الأغشية ناعمة ، وهو دليل على الحفاظ الجيد. يمكن التعرف على جميع العضيات ، مثل النواة والميتوكوندريا والفجوات بشكل مثالي.

لوحظ أيضا حفظ ممتاز في سوط الليشمانيا ، والمثقبية البروسي ، والإشريكية القولونية. في النواة ، يكون الغشاء المزدوج الذي يشكل الغلاف النووي ، والمسام النووية ، وجسم عمود المغزل ، والريبوسومات المتصلة بالغشاء الخارجي للغلاف النووي مرئية بوضوح. في الميتوكوندريا ، تكون غزوات الغشاء الداخلي ، التي تسمى cristae ، مرئية بوضوح.

العضيات الحرجة هي الفجوات ، لأن بلورات الجليد الكبيرة يمكن أن تتطور بسهولة. في الصورة ، يتم الحفاظ على الفجوات بشكل مثالي دون تلف بلورات الجليد. يمكن أيضا استخدام طريقة استبدال التجميد / التجميد الغرق لأداء توطين البروتين المناعي.

يحافظ الإجراء على مضادات البروتين تماما ، وكما ذكرنا سابقا ، يتم تحديد العضيات بوضوح. تم بالفعل اختبار الأجسام المضادة المختلفة لاستهداف بروتينات مختلفة في الخميرة ، مثل سينسيز مضاد ATP ومضاد للبورين. مثل هذه التجربة ممكنة أيضا لأنظمة تجريبية مختلفة ، كما هو الحال في الليشمانيا ، حيث تم توطين بروتين فلابارين.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير العينات باستخدام طريقة استبدال التجميد / التجميد الغرق لتصورها في المجهر الإلكتروني للإرسال. هذه التقنية سريعة وسهلة الاستخدام ومنخفضة التكلفة وتوفر الحفاظ الممتاز على البنى التحتية للخلايا. كن حذرا مع النيتروجين السائل ، ولكن بشكل خاص مع رابع أكسيد الأوزميوم وخلات اليورانيل.

يجب التعامل معها في غطاء الدخان أثناء ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك معطف المختبر والقفازات.