قياس النتريت والنترات، الأيضية في اكسيد النيتريك المسار، في المواد البيولوجية باستخدام أسلوب التوهج

الهدف من هذا البروتوكول هو استخدام التلألؤ الكيميائي لتحديد أكسيد النيتريك في العينات البيولوجية عن طريق القياس الكمي لمستويات النتريت والنترات ، باستخدام محاليل اختزال ثلاثي يوديد وكلوريد الفاناديوم. يوفر هذا البروتوكول أداة قوية لتتبع استقلاب أكسيد النيتريك والإشارات ، إقليميا وطوليا من مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي بساطتها وحساسيتها العالية.

ستظهر هذا الإجراء كاتلين كاسيل ، زميلة IRTA لدينا. ستوضح لنا كيفية قياس النتريت عن طريق التلألؤ الكيميائي إلى جانب محلول ثلاثي يوديد. للبدء ، اصنع محلولا للحفاظ على النتريت.

تحضير محلول يحتوي على 118 ملليمولار NEM و 890 ملليمولار من البوتاسيوم والفيروسيانيد في الماء المقطر. قم بإذابة المواد الصلبة حتى يصبح المحلول أصفر شفافا بدون بلورات. ثم أضف هذا الحل إلى NP 40 بنسبة حجم 9 إلى 1 حسب الحجم.

امزج المحلول برفق لتجنب الرغوة. لا تقم أبدا بدوامة هذا الخليط. يمكن استخدام محلول الحفاظ على النتريت لمدة أسبوع تقريبا إذا تم تخزينه عند 4 درجات مئوية.

يمكن استخدام البروتوكول في العديد من العينات البيولوجية التي تم الحصول عليها حديثا. في هذه الحالة ، تم طرد الدم المسحوب حديثا للحصول على عينة بلازما للاختبار. من المهم جدا معالجة الدم أو أي عينات بيولوجية تحتوي على كمية كبيرة من بروتينات الهيم ، مثل الهيموجلوبين أو الميوغلوبين في أسرع وقت ممكن ، لأن بروتينات الهيم ستتفاعل مع النتريت ، وتدمر النتريت.

الآن ، من أجل الحفاظ على معظم نتريت الدم الداخلي ، قم بخلط البلازما على الفور بمحلول حافظ على النتريت بنسبة 1 إلى 4 من الحجم حسب الحجم. خلال أي مرحلة من مراحل هذا التحضير ، يمكن تجميد العينة على الثلج الجاف. لإزالة البروتين من العينة ، امزجها مع جزء متساو من الميثانول البارد.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 13000 جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لترسيب البروتينات. خذ المادة الطافية واستخدمها لقياس النتريت. بالنسبة للقياس الحساس للنتريت ، يعتبر محلول تقليل ثلاثي يوديد أكثر فعالية.

عند تحضيره ، تأكد من ذوبان جميع البلورات. احتفظ بالمحلول في زجاجة داكنة واستخدمه في غضون أسبوع واحد من التحضير. يوفر محلول تقليل كلوريد الفاناديوم أكبر قدر من الدقة لقياس النترات.

يتم استخدام محلول 1 ميكرومولار من النتريت لتحديد المنحنى القياسي للنتريت ، وكذلك النترات. قم بإعداد محلل أكسيد النيتريك وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. أولا ، افتح خزان الأكسجين ، وقم بتشغيل الجهاز ، وقم بتوصيله بمصيدة حمض تحتوي على هيدروكسيد الصوديوم المولاري.

بعد ذلك ، افتح خزان الهيليوم ، ثم قم بتوصيل غرفة التفاعل الزجاجي بخزان الهيليوم. الآن ، قم بتحميل غرفة التفاعل بمحلول ثلاثي يوديد لقياس النتريت. أضف عامل مضاد للرغوة.

اضبط معدل تدفق الغاز لإبطاء الفقاعات. ثم قم بتوصيل مصيدة الحمض بغرفة التفاعل. باستخدام التجربة والخطأ ، اضبط تدفق الهيليوم بشكل صحيح ، ليتناسب مع شفط الجهاز.

الآن ، ابدأ تشغيل البرنامج السائل القائم على البرمجة المرئية. أولا ، قم بتمكين الاتصال بين الأداة وبرنامج الاستحواذ من قائمة البيانات ، ثم من القائمة الرئيسية على اللوحة الأمامية ، ابدأ التحليل. انتظر حتى يبرد مبرد المضاعف الضوئي أقل من 12 درجة مئوية تحت الصفر ، ويستقر المضاعف الضوئي.

بعد حوالي 30 دقيقة ، سيكون خط الأساس قد استقر في حدود 1 أو 2 مللي فولت. استقرار القيمة أمر بالغ الأهمية وليس القيمة نفسها. بعد استقرار المحلل ، استخدم حقنة هاميلتون مغسولة جيدا لحقن المحاليل.

أولا ، قم بحقن ثلاثة أحجام مختلفة على الأقل من معيار النتريت 1 ميكرومولار. حقن المحاليل في محلول الاختزال من خلال الحاجز. حقن كل معيار أو عينة مرتين.

إذا كان من المتوقع ارتفاع مستويات النتريت والعينات ، ففكر في حقن حجم رابع كبير من محلول النتريت القياسي لتحديد ميل المنحنى القياسي بشكل أفضل. راقب دائما الإخراج وانتظر حتى يعاد المحلل الاستقرار إلى خط الأساس قبل حقن العينة التالية. يستغرق هذا دقيقة على الأقل.

استخدم أحجام العينات التي تصل إلى ذروتها أقل من 700 مللي فولت للحصول على نتائج دقيقة. بين الجري ، اغسل المحقنة جيدا بالماء منزوع الأيونات. من المهم جدا غسل المحقنة جيدا.

بعد إجراء جميع القياسات ، اضغط على خيار الإيقاف في البرنامج. سيتم حفظ البيانات تلقائيا. سيؤدي الضغط على إجهاض إلى إنهاء القياس دون حفظ البيانات.

أغلق قضيب التوقف أعلى وعاء التفاعل وافصل الأنبوب الذي يربط المصيدة الحمضية ووعاء التفاعل. بعد التجربة ، ضع المحلل في وضع الاستعداد. اضغط على التحليل على اللوحة الرئيسية وتأكد من دخوله في وضع الاستعداد.

بعد ذلك ، قم بإيقاف تشغيل إمداد الأكسجين. افصل الأنابيب من خزان O2 إلى المصيدة الحمضية. ثم اغسل محلول ثلاثي يوديد باستخدام الهيليوم.

بعد ذلك ، أغلق وافصل خزان الهيليوم عن وعاء التفاعل الزجاجي. أخيرا ، نظف الوعاء باستخدام الإيثانول والماء حسب الحاجة. تظهر معايير الاختبار جنبا إلى جنب مع عينات البلازما أنه بعد حقنها مباشرة ، يزداد جهد المضاعف الضوئي ويعود إلى خط الأساس بمجرد تقليل كل النتريت ، والذي قد يستغرق ما يصل إلى دقيقة.

لتحديد الإشارة ، تم إنشاء منحنى قياسي من المعايير ، باستخدام المنطقة الواقعة أسفل ذروة قفزة الجهد. باستخدام المنحنى القياسي ، كان القياس الكمي للعينات قابلا للتكرار بين حقنها المكرر. يعتبر التلألؤ الكيميائي المعيار الذهبي لتحديد تركيزات النتريت.

بمجرد إتقانها ، يكون حد حساسية النتريت منخفضا يصل إلى عشرين ملليمولار. أهم شيء للعمل مع التلألؤ الكيميائي هو الدقة. نظرا للحساسية العالية للطريقة ، فإن كل خطأ سيؤثر على النتيجة النهائية.

لذا خذ وقتك ولا تتسرع. بعد تطوير هذه التقنية في أوائل عام 2000 ، مهدت الطريق للباحثين لاستكشاف مسارات التمثيل الغذائي لأكسيد النيتريك ، ومعرفة أن نقص أكسيد النيتريك يسبب العديد من الأمراض ، وخاصة أمراض القلب والأوعية الدموية.